下調miR-20a靶向負調控ZNF259抑制肺癌H322細胞侵襲遷移并誘導凋亡

李虹澤 曹鋒 章敏

(武漢市金銀潭醫院 1檢驗科，湖北 武漢 430023；2外科)

近年研究發現，肺癌的發生與基因的異常表達有關，這些基因參與調控肺癌的進展和轉移，也是近年來分子靶向治療的研究熱點〔1〕。研究發現，miRNA與腫瘤進展有關，參與調控腫瘤細胞的惡性增殖、轉移等過程〔2〕。miR-20a是一個作用十分廣泛的miRNA分子，在人類的多種組織和器官中均有表達，參與細胞的分化、增殖、凋亡等過程，與先兆子癇、類風濕關節炎等疾病進展有關〔3，4〕。研究報道，miR-20a還參與人類腫瘤的發生，沉默miR-20a具有抵抗白血病發生的作用，miR-20a在宮頸癌中高表達與腫瘤患者的預后有關，miR-20a具有促進前列腺癌惡性進展的作用〔5～7〕。研究顯示，miR-20a在肺癌組織中的表達水平高于正常組織，其高表達可能與肺癌的進展有關〔8〕。目前對于miR-20a在肺癌細胞生物學特性中的作用尚不明確。本實驗探討miR-20a在肺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲中的作用和機制，為靶向基因治療肺癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 正常肺上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞A549、Spc-A1、H322購自上海歌凡生物細胞庫；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體、ZNF259抗體購自美國Invitrogen；本實驗引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miR-20a inhibitor、inhibitor control、miR-20a mimics、mimics control均由吉滿生物科技(上海)有限公司合成構建；C-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體、MMP-2抗體、C-Caspase-9抗體購自美國Abcam；ZNF259 siRNA、siRNA control購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2Realtime PCR檢測miR-20a在肺癌細胞中的表達水平 收集正常肺上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞A549、Spc-A1、H322，按照Trziol試劑提取各細胞中的總RNA。總RNA經紫外分光光度計測定其純度及濃度后，進行逆轉錄反應，逆轉錄步驟同miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，cDNA合成條件為：16℃孵育30 min，42℃孵育30 min，80℃孵育15 min，4℃孵育10 min。使用SYBR Green進行定量PCR，PCR條件為：95℃孵育3 min，95℃孵育12 s，58℃孵育30s，共30個循環。把U6設置為內參，根據PCR過程中的CT值計算miR-20a水平，計算方法采用2-△△CT法。引物序列為：U6正義5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-20a正義5′-GCGAGATCTAGTTGTGCAAATCTATGC-3′，反義5′-GGCGAATTCTAACCATAGAACAGTGTTC-3′。

1.3細胞轉染 在肺癌細胞中分別轉染miR-20a inhibitor和inhibitor control，轉染試劑用Lipofectamine 2000，轉染操作同轉染試劑說明。將轉染miR-20a inhibitor和inhibitor control后的細胞命名為Anti-miR-20a和Anti-NC。把沒有轉染的細胞命名為Control。在細胞轉染后1 d，按照1.2中Realtime PCR方法測定下調效果。

1.4四甲基偶氮唑藍(MTT)方法測定細胞增殖變化 按照Control、Anti-NC、Anti-miR-20a分組方法將肺癌細胞按照每孔100 μl的細胞懸浮液接種到96孔板中，細胞培養1 d后，在細胞中添加MTT溶液(體積15 μl)，放在37℃，5% CO2培養箱中培養4 h。將孔內的上清液體吸棄，添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，搖床震蕩反應10 min。以不含細胞的孔調零以后，在酶標儀上檢測波長470 nm的OD值。

1.5流式細胞儀測定細胞凋亡變化 取培養1 d后的Control、Anti-NC、Anti-miR-20a細胞，每組收集約106個細胞，添加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次細胞，最后用結合緩沖液將細胞懸浮，再依次添加PI和Annexin V-FITC染液各5 μl。在60min內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6Transwell小室測定細胞侵襲和遷移變化 細胞侵襲和遷移實驗均用Transwell小室，侵襲實驗前用基質膠將小室濕化，遷移實驗不用基質膠濕化，其余步驟相同。步驟如下：將Control、Anti-NC、Anti-miR-20a細胞懸浮在不含血清的培養液中，吸取200 μl添加到8 μm孔徑的Transwell小室的上室中，在下室中添加600 μl含血清細胞培養液。培養1 d后，用甲醇固定細胞30 min，結晶紫染色后，在顯微鏡下隨機選取5個視野統計穿膜細胞數目。

1.7Western印跡檢測細胞中C-Caspase-3、MMP-2、C-Caspase-9、MMP-9蛋白表達變化 常規方法使用蛋白裂解試劑提取Control、Anti-NC、Anti-miR-20a(培養1 d)細胞總蛋白。蛋白定量方法為二喹啉甲酸(BCA)法，定量步驟同試劑盒。將蛋白同上樣緩沖液混合煮沸，添加到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣孔中，每個孔按照40 μg蛋白樣品計算。SDS-PAGE用10%分離膠和5%濃縮膠。在分離膠中采用90 V電壓電泳，在濃縮膠中采用100 V電壓電泳。在90 V電壓條件下將凝膠上的蛋白轉移到裁剪合適大小的NC膜上。NC膜經過含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封閉液在室溫中封閉90 min后，再與一抗反應液(C-Caspase-3按照1∶400稀釋、C-Caspase-9按照1∶400稀釋、MMP-2按照1∶800稀釋、MMP-9按照1∶800稀釋)在室溫中孵育90 min。最后將NC膜放在1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗中，在室溫中孵育1 h。以ECL顯色，Image J分析條帶的灰度值，把β-actin作為內參，分析目的蛋白表達變化。

1.8miR-20a靶基因預測和鑒定 經過生物信息學軟件發現miR-20a與ZNF259的3′UTR端有結合位點，將ZNF259的3′UTR端結合位點突變，構建突變型(MUT)熒光素酶報告載體(pmiRGLO)，同時構建含有ZNF259的3′UTR野生型(WT)熒光素酶報告載體。把WT和MUT分別用miR-20a mimics和 mimics control共轉染到肺癌細胞中，用雙熒光素酶活性報告測定試劑盒檢測熒光素酶活性。用Western印跡方法檢測Control、Anti-NC、Anti-miR-20a(培養1 d)細胞中ZNF259蛋白表達變化，步驟同上。

1.9ZNF259 siRNA對下調miR-20a的肺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響 將miR-20a inhibitor、ZNF259 siRNA和miR-20a inhibitor、siRNA control共轉染到肺癌細胞中，命名為Anti-miR-20a+si-ZNF259、Anti-miR-20a+si-NC。按照上述步驟以MTT、流式細胞儀、Transwell小室、Western印跡檢測細胞增殖、凋亡、侵襲遷移和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、ZNF259、MMP-9蛋白表達變化。

1.10統計分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1miR-20a在肺癌細胞中高表達 肺癌細胞A549、Spc-A1、H322中miR-20a表達水平(1.89±0.13、1.40±0.12、2.36±0.23)明顯高于正常肺上皮細胞BEAS-2B(1.00±0.09，P<0.05)，且H322細胞中miR-20a表達水平明顯高于Spc-A1、A549(P<0.05)。miR-20a在肺癌細胞中高表達，選用表達水平最高的H322細胞作后續實驗。

2.2miR-20a inhibitor下調肺癌細胞中miR-20a表達 Anti-miR-20a組miR-20a表達水平(0.32±0.03)明顯低于Anti-NC組(0.98±0.11，P<0.05)，Control組(1.00±0.10)與Anti-NC組、Anti-miR-20a組比較差異有統計學意義(F=58.591，P=0.000)。miR-20a inhibitor下調肺癌細胞中miR-20a表達水平。

2.3下調miR-20a對肺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白的影響 在肺癌細胞中轉染miR-20a inhibitor，細胞增殖能力降低，凋亡率升高，細胞遷移和侵襲數目減少，細胞中促凋亡蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-9表達水平升高，腫瘤轉移促進因子MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖1，圖2，表1。

表1 各組OD值、凋亡率、侵襲數目、遷移數目和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白表達

圖2 流式細胞儀方法檢測肺癌細胞凋亡率

圖1 Western印跡方法檢測C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白表達

2.4miR-20a靶向調控ZNF259表達 miR-20a與ZNF259的3′UTR端有堿基互補結合位點(圖3)，且WT和miR-20a mimics共轉染后的肺癌細胞熒光素酶活性(0.37±0.06)顯著低于mimics control組(1.00±0.12;t=8.133,P=0.001)。而MUT和miR-20a mimics共轉染后(0.99±0.11 vs 1.00±0.88)無明顯變化(t=0.127，P=0.905)。

圖3 miR-20a與ZNF259的3′UTR端結合位點

2.5miR-20a inhibitor促進ZNF259表達 轉染miR-20a inhibitor后的肺癌細胞中ZNF259蛋白水平(0.79±0.09)明顯高于Anti-NC組(0.47±0.6，P<0.05)。Control組(0.50±0.07)與Anti-NC組、Anti-miR-20a組差異有統計學意義(F=16.934，P=0.003),見圖4。

圖4 Western印跡檢測miR-20a inhibitor對肺癌細胞中ZNF259蛋白表達的影響

2.6ZNF259 siRNA逆轉下調miR-20a對肺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與轉染miR-20a inhibitor、siRNA control的肺癌細胞比較，共轉染miR-20a inhibitor、ZNF259 siRNA后的肺癌細胞增殖能力升高，細胞凋亡率降低，細胞遷移和侵襲數目增多，細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，ZNF259蛋白水平下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5，表2，圖6。

圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表2 ZNF259 siRNA和miR-20a inhibitor共轉染對肺癌細胞OD值、凋亡率、侵襲數目、遷移數目和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9、ZNF259蛋白表達的影響

圖6 Western印跡方法檢測細胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、ZNF259、MMP-9蛋白表達

3 討 論

miR-20a是具有調節多種細胞如成骨細胞、內皮細胞生長、分化的調節因子，不僅與正常組織生長和胚胎發育有關，還參與人類疾病的發生〔9，10〕。目前已經發現miR-20a在皮膚損傷等相關疾病中發揮重要調節作用，對于miR-20a在腫瘤中的作用是目前研究的熱點〔11〕。在胃癌中證實，miR-20a具有增加胃癌細胞順鉑抵抗性的作用，miR-20a表達下調可以促進胃癌細胞凋亡發生〔12〕。miR-20a高表達促進卵巢癌細胞轉移〔13〕。研究報道，miR-20a在肺癌組織中的陽性率明顯高于對應癌旁組織，且其表達水平的高低與腫瘤患者臨床病理分期有關〔14〕。本實驗結果說明下調miR-20a抑制肺癌細胞惡性表型，靶向抑制miR-20a可能是治療肺癌的有效途徑。

腫瘤細胞惡性表型與細胞內相關蛋白表達有關，這些蛋白受到細胞內調控基因的直接或間接調節作用〔15〕。Caspase蛋白家族是目前已經發現的與細胞凋亡關系最為密切的凋亡調節蛋白，其受到凋亡信號影響后可以通過自我活化的方式誘導Caspase凋亡反應，最終促進細胞凋亡發生〔16〕。Caspase-3和Caspase-9是凋亡反應的下游和上游因子，只有被激活形成C-Caspase-3和C-Caspase-9后才可以發揮凋亡促進作用〔17〕。MMP-9和MMP-2具有降解細胞外基質的作用，也是目前為止發現的與腫瘤轉移關系最為密切的基質降解酶〔18〕。本研究結果說明下調miR-20a抵抗肺癌細胞轉移并誘導細胞凋亡發生，與檢測細胞凋亡和侵襲、遷移能力結果相符合。

目前對于miRNA分子調控機制的研究顯示，miRNA分子通過靶向調控下游基因的表達發揮生物學作用，且在不同組織或生理、病理過程中，同一個miRNA分子的靶向調控機制不同〔19〕。miR-20a作為一個與腫瘤有關的miRNA分子，目前在不同的腫瘤中已經證實其具有多個靶基因，如PTEN、ABL2等〔20，21〕。本實驗發現ZNF259可能是miR-20a的靶基因，且ZNF259受到miR-20a的負調控作用。研究報道，ZNF259具有抑制肺癌細胞增殖、侵襲的作用，ZNF259在肺癌進展中發揮抑制作用〔22〕。本實驗發現，下調ZNF259具有逆轉下調miR-20a抗肺癌細胞的作用，說明miR-20a通過靶向ZNF259調控肺癌細胞惡性表型。

綜上，miR-20a在肺癌進展及惡性轉移過程中可能發揮促進作用，其在肺癌細胞中高表達，下調miR-20a具有抑制肺癌細胞惡性表型并誘導細胞凋亡的作用，其作用機制與靶向調控ZNF259有關。