牙齦卟啉單胞菌PrtC蛋白體外表達、純化及功能初探

高曉雪，汪 穎，夏 榮

牙周炎是一種由細菌感染引起的牙周支持組織破壞的慢性進行性疾病[1]。牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)被認為是牙周病主要致病菌之一[2]。P.gingivalis能夠分泌多種毒力因子，產生多種胞外蛋白酶，如牙齦素、膠原酶、肽酶等，可對牙周組織產生破壞[3]。蛋白酶可以降解多種蛋白質和多肽底物，破壞牙周組織細胞，誘導與組織破壞、骨吸收相關的致炎細胞因子的產生[4]。而PrtC蛋白正是這些蛋白酶中的一種。

1992年，Kato et al[5-6]發現膠原酶PrtC來源于牙齦卟啉單胞菌ATCC53977，能夠降解I型膠原蛋白，在牙周組織的破壞和牙周病的發展過程中發揮重要作用。然而有研究[7]表明prtC基因編碼的產物不能降解膠原的底物以及沒有與真核動物膠原酶相似的Zn2+結合區域，因此對其是否是真正的膠原酶地位提出了質疑。該研究以牙齦卟啉單胞菌ATCC33277PrtC蛋白為研究對象，通過原核表達體系，體外表達出PrtC蛋白，并驗證其是否具有降解膠原的功能，以期獲得較好的蛋白質晶體為將來設計分子藥物提供結構基礎。

1 材料與方法

1.1 材料包含prtC基因全長的PUC57克隆質粒(上海生物工程技術服務公司合成)；PCR引物(南京擎科生物科技有限公司合成)；克隆載體p29(美國Invitrogen 公司的pET29b載體改造)；PCR試劑盒(美國Promega公司)；DNA回收試劑盒(上海華舜生物工程公司)；鎳離子親和層析、預裝柱凝膠過濾層析HiLoad 16/60 Superdex 200(美國GE Healthcare公司)；DNA測序(上海生物工程技術服務公司)；無抗性Top10 菌株及克隆、質粒擴增選用無抗性 BL21(DE3)(美國Invitrogen 公司)；膠原蛋白I型(美國Solarbio公司)；抗His標簽抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG (美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1prtC基因的生物信息學分析 利用Protparam軟件對PrtC蛋白序列進行理化性質分析，包括氨基酸組成、分子量、半胱氨酸的個數等，并利用ProtScale軟件分析基因表達產物各氨基酸的親水性/疏水性，應用Multalin interface page進行序列比對，BLAST預測其結構域。

1.2.2prtC基因分子克隆 全基因合成牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的prtC基因序列(AP009380.1)，密碼子優化后用CloneExpress同源重組方法構建質粒。在設計引物時要設計目的基因以及載體線性化的引物，目的基因的正反向引物要和載體的線性化引物有15～20 bp的同源序列，這樣可以在重組酶ExnaseⅡ的催化下發生同源重組。Primer5軟件設計prtC基因引物，上游引物:5′-AAGAAGGGAGATATACATATGAAAGAAATGAACGTGAAT-3′；下游引物:5′-GTGGTGGTGGTGCTCGAGTTCTTCACG TTTATCGAAACGG-3′。p29載體線性化上游引物：5′-CTCGAGCACCACCACCACCACCAC-3′，下游引物：5′-ATGTATATCTCCCTTCTT-3′。PCR擴增外源基因片段后，通過凝膠電泳確定PCR產物并利用PCR清潔試劑盒進行產物回收。p29載體線性化產物使用DpnI酶在37 ℃水浴下處理2 h，并在重組酶ExnaseⅡ作用下將目的基因片段與線性化處理載體進行連接。轉化到Top10感受態菌株，進行菌液PCR檢測。依據核酸電泳結果選取菌液 PCR中呈陽性的菌液進行測序。

1.2.3PrtC蛋白的小量原核表達檢測和大量表達純化 將構建成功的重組質粒分別轉入 BL21(DE3)和 pKY206(DE3)感受態細胞中，其中大腸桿菌表達菌株BL21添加了T7聚合酶基因，為T7表達系統而設計的，而表達菌株pKY206帶有質粒表達分子伴侶，能夠幫助蛋白質折疊。分別在 37 ℃和16 ℃條件下誘導表達4 h和20 h。將上清液和沉淀分別制蛋白樣，進行SDS-PAGE檢測。按照表達檢測摸索的蛋白最佳表達條件，進行擴大培養。將擴大培養后收集到的菌塊，使用預冷的緩沖液A(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，14 mmol/L β-MER, 1 mmol/L EDTA-Na2，5% glycerol pH7.5)進行超聲破碎，12 000 r/min離心后用40 mmol/L咪唑的緩沖液A洗脫雜蛋白，最后用400 mmol/L咪唑緩沖液B(20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，14 mmol/L β-MER，1 mmol/L EDTA-Na2，5% glycerol pH7.0)洗脫目的蛋白并收集，在緩沖液B的環境中上樣至分子篩Superdex 200，收集蛋白樣品，使用SDS-PAGE分析。

1.2.4Western blot鑒定純化的PrtC蛋白 切取純化PrtC重組蛋白的SDS-PAGE所需條帶，250 mA、60 min轉印至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉搖床上37 ℃封閉1 h，TBST洗膜3次；加入1 ∶2 000稀釋的抗His標簽抗體為一抗，37 ℃孵育1 h。洗膜后加入1 ∶3 000稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育45 min。ECL底物發光顯影定影試劑盒顯色，使用X線曝光分析結果。

1.2.5PrtC蛋白膠原酶功能實驗 將蛋白稀釋到1 mg/ml，eppendorf 離心機12 000 r/min、4 ℃離心10 min，吸出轉移至干凈滅菌EP管中。稱取3 mg膠原蛋白溶于1 ml TES buffer。分別設置五個時間梯度(10、14、18、24、32 h),反應體系設為10 μl。將膠原蛋白、PrtC蛋白各自的對照組,膠原與PrtC蛋白混合的實驗組同時放入30 ℃恒溫水浴反應直到實驗結束后，加入1 μl的EDTA-Na2終止反應，再加入5×loading buffer，制取蛋白樣，10%SDS-PAGE鑒定。

2 結果

2.1 PrtC蛋白的生物信息學分析結果prtC基因編碼的蛋白質包含417個氨基酸,分子量為47 ku，理論等電點為6.2，有9個Cys。應用ProtScale Server進行親水性/疏水性預測，多肽鏈第100、103位的I、D親水性最強(-2.378)，第404位的R疏水性最強(1.800)，其親水性氨基酸數目多于疏水性氨基酸(圖1)。Multalin interface page序列比對結果顯示，來源于牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的PrtC氨基酸序列比ATCC53977在N端多出83個氨基酸殘基，相似度為72.4%(圖2)。BLAST預測其有兩個結構域，分別是N端蛋白酶U32家族(Peptidase_U32 superfamily)結構域(10～362位)，推測其可能為膠原酶的催化結構域，C端翻譯因子(Translation_Factor_Ⅱ_)結構域(331～402位)(圖3)。

圖1 親水性/疏水性預測結果

2.2 PrtC蛋白表達載體的構建以PUC57質粒載體為PCR模板，PCR擴增得到約1 251 bp的目的片段，p29載體線性化擴增到約5 370 bp，其大小均與預期值相符(圖4)。通過重組酶體系將載體和基因片段連接后，轉化到感受態Top10。挑取單克隆，菌液PCR結果(圖5)，陽性結果顯示測序正確。

2.3 PrtC蛋白的小量表達檢測和大量表達純化從SDS-PAGE結果中明顯可見目的蛋白表達，在45 ku上方有一條蛋白條帶,其大小與PrtC蛋白的分子量相符。由于大腸桿菌表達菌株pKY206分子伴侶與目的蛋白大小相近，會產生干擾，因此選擇BL21表達菌株16 ℃這個條件進行擴大培養。見圖6。將重組質粒p29-prtC 轉化到表達菌株BL21，培養后使用0.2 mmol/L IPTG 誘導重組蛋白表達。使用400 mmol/L咪唑緩沖液A經鎳柱把目的蛋白洗脫下來,電泳結果見圖7，由SDS-PAGE可知目的蛋白的純度大于95%。

圖2 不同菌株PrtC蛋白序列比對

圖3 結構域預測

圖4 PCR擴增結果

圖5 菌液PCR

使用分子篩Superdex200進行純化，A280吸收監測顯示：目的蛋白PrtC峰型對稱，出峰位置在65 ml，通過標準曲線(Velution=289.8-43.2×logMr)計算出PrtC蛋白在分子篩上顯示出的分子量是160 ku，PrtC單體的分子量是47 ku表明PrtC蛋白以三體形式存在于溶液中。但分子篩出峰較寬，表明蛋白狀態較好，可用于晶體學研究(圖8)。

圖6 PrtC表達檢測SDS-PAGE分析

圖7 PrtC鎳柱親和層析蛋白電泳圖

圖8 分子篩Superdex200 16/60 GL的A280吸收峰

2.4 Western blot鑒定純化的PrtC蛋白PrtC重組蛋白經過在大腸桿菌體內破碎離心、Ni2+柱親和層析，洗脫液中得到被純化的6×His-PrtC重組蛋白。以鼠抗His Tag單克隆抗體為一抗，進行Western blot檢測，其結果顯示了純化的蛋白為PrtC重組蛋白(圖9)。

圖9 Western blot結果

2.5 PrtC蛋白膠原酶功能實驗結果由10% SDS-PAGE可知，隨著時間的增長，實驗組PrtC蛋白加入膠原蛋白溶液后,在32 h膠原蛋白的條帶變得非常的淺，而且在35 ku可見一條帶，推測可能是膠原蛋白發生降解產生。而作為對照組的PrtC蛋白和膠原蛋白從實驗開始就放入30 ℃水浴鍋直到結束，它們的條帶幾乎沒有變化，也沒有出現降解條帶，因此證明PrtC蛋白具有降解膠原蛋白的能力(圖10)。

3 討論

P.gingivalis是一種革蘭陰性厭氧桿狀細菌，已從晚期成人牙周炎的病變中分離出來。prtC基因序列是來自于已經被完全測序的全基因組牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌株[8]，而牙齦卟啉單胞菌ATCC53977這個菌株的全基因組序列并沒有測序完成。生物信息學分析：PrtC蛋白的氨基酸序列中大部分為親水性氨基酸，可獲得可溶性表達。來源于牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的PrtC蛋白氨基酸序列比ATCC53977的氨基酸序列在N端多出83個殘基，第133～163位氨基酸組成有明顯不同，盡管ATCC53977被證明有膠原酶活性，但ATCC33277是否有此功能，還沒有研究證實。BLAST發現PrtC蛋白有兩個結構域，分別是蛋白酶U32家族和翻譯因子，可見N端的U32蛋白酶家族結構域保守，是蛋白酶活性中心。蛋白酶U32家族中第一個被解析的結構是來自于甲烷嗜熱菌中的基因mk0906編碼的蛋白酶U32結構域，揭示U32蛋白酶結構域是一個TIM-桶狀結構,該蛋白的四級結構是個二聚體。序列比對發現Mk0906與牙齦卟啉單胞菌序列的相似性低于20%，所以Mk0906不能降解I型膠原蛋白[9]。并且也有研究[10-11]表明P.gingivalis可以通過影響宿主細胞基質金屬蛋白酶(MMP)的表達、激活和抑制來誘導宿主膠原降解。研究人員提出PrtC蛋白可能與P.gingivalis或宿主細胞的脂多糖或MMP產生的其他因子聯合作用，在牙周炎的發生發展過程中起作用[12-13]。因此對prtC基因產物在膠原分解活性中的作用提出了質疑[14]。本實驗初步證明PrtC蛋白能降解I型膠原蛋白，后續將通過同位素標記的方法繼續驗證膠原酶降解膠原的功能。本研究同樣也使用了微流控晶體初篩機器人(Mosquito),進行了晶體的初篩，沒有發現晶體形成,于是將PrtC蛋白氨基酸序列與其他物種中的同源蛋白的氨基酸序列進行比對，結果顯示這些序列非常保守，只有N端的幾個氨基酸序列同源性較低，后期考慮設計N端的截短版、加配體等方法篩晶體。

圖10 PrtC蛋白酶解SDS-PAGE

本研究將prtC基因連接到p29質粒，得到的重組質粒能夠表達含6×His標簽的重組蛋白。將重組質粒轉化到表達菌株大腸桿菌BL21，使用IPTG誘導表達重組蛋白，然后再用鎳柱親和層析法、分子篩層析(Superdex 200)預裝柱純化，Western blot驗證目的蛋白。通過膠原酶功能實驗，初步證明牙齦卟啉單胞菌ATCC33277PrtC蛋白能夠將Ⅰ型膠原蛋白降解。由于目前沒有人解析PrtC蛋白的晶體結構，而本實驗中也沒有得到蛋白晶體，所以將繼續嘗試使蛋白的狀態更好，更穩定、均一，為得到蛋白晶體并解析結構，了解其在牙周病發生中致病機制和研制臨床藥物提供理論基礎。