牙髓干細(xì)胞與血管周細(xì)胞性能比較研究

吳文婧，丁如愿，張 菁，張紅艷，胡露露，李 頌

血管新生是組織修復(fù)的基礎(chǔ)，血管新生異常常常影響機體損傷的正常愈合。血管由內(nèi)襯血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞層和血管周細(xì)胞組成。研究[1]表明，在血管形成過程中，首先由增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)，然后血管周細(xì)胞遷移聚集，2 種細(xì)胞共同調(diào)節(jié)血管的穩(wěn)定性。周細(xì)胞在全身毛細(xì)血管和微血管周圍廣泛分布，能夠穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，對血管的發(fā)育以及重塑具有重要作用。然而，現(xiàn)階段分離血管周細(xì)胞還有一定的困難，這限制了其在體外血管重建中的運用。有研究[2-4]報道，來源于腦組織、臍帶、脂肪等的間充質(zhì)干細(xì)胞和血管周細(xì)胞有許多相似之處，這些間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞表型、基因表達(dá)和分化能力等方面與血管周細(xì)胞有著高度的相似性。但是，這些組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞獲取困難，相對來說，來源于牙髓的牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有無創(chuàng)傷、易于分離、增殖率高等優(yōu)勢，可以從第三恒磨牙、正畸牙或其他原因拔除的健康牙的牙髓組織中分離培養(yǎng)獲得，而不受倫理問題的影響。在該研究中，選擇血管穩(wěn)定能力、遷移功能和干性分化潛能作為評價標(biāo)準(zhǔn)，比較DPSCs和血管周細(xì)胞之間的相似性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器原代血管周細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)(美國Sciencell公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；周細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Sciencell公司)和ECM培養(yǎng)基(Lonza公司)；Transwell 細(xì)胞小室(美國BD公司)；DMEM 培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；Dispase 酶和Ⅰ型膠原酶( 美國Sigma 公司)；CO2恒溫孵箱(英國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1DPSCs的分離培養(yǎng)與鑒定 取臨床小于25歲健康患者因正畸或阻生拔除健康無齲的牙齒，拔出后立即放入含5%雙抗PBS中，搖晃沖掉牙根表面血跡，立即冰盒保存，送至實驗室。4 h內(nèi)將牙齒放入超凈工作臺，用無菌紗布包裹牙齒，錘子砸開牙齒，超凈工作臺內(nèi)分開牙齒，鑷子取出牙髓，去掉根尖1/3根髓，將牙髓移入無菌培養(yǎng)皿中，用2%雙抗PBS反復(fù)沖洗干凈。將牙髓組織剪碎后移入15 ml離心管中，加入1 ml 濃度為3 mg/ml膠原酶和1 ml濃度為4 mg/ml Dispase酶，混勻后37 ℃震蕩消化40～60 min，加入培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，細(xì)胞重懸于20% 胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液中，吹打混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5 d后觀察細(xì)胞生長情況，以后3 d換液，培養(yǎng)10～12 d，當(dāng)細(xì)胞長至約90%融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取P3代DPSCs，PBS 洗滌2次，用胰酶消化收集，以1×106/ml分裝至1.5 ml EP管，分別加入CD105、CD29、CD90、CD73、CD45、CD44、CD34 抗體，4 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌后重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2多向誘導(dǎo)分化 成骨分化：以4×103/cm2接種于12孔板上，培養(yǎng)至70%融合度時，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含α-MEM，10% FBS, 1%雙抗, 50 μg/ml 磷酸抗壞血酸, 10 mmol/L β-磷酸甘油, 10 nmol/L地塞米松, 10 nmol/L 1,25二羥基維生素D3)培養(yǎng)4周，每3 d換液1次。誘導(dǎo)4周后，用10%中性緩沖福爾馬林固定1 h，棄去固定液，用雙蒸水沖洗3次，加入茜素紅染色。

成神經(jīng)分化：以4×103/cm2接種于12孔板上，培養(yǎng)至70%融合度時，更換成神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，40 ng/ml 成纖維細(xì)胞生長因子, 20 ng/ml 表皮生長因子)培養(yǎng)4周，每3 d換液1次。誘導(dǎo)4周后，檢測成神經(jīng)分化。

1.2.3體外成血管實驗 預(yù)先對48孔板進(jìn)行基質(zhì)膠涂層，按照DPSC+HUVEC(1 ∶4)、血管周細(xì)胞+HUVEC(1 ∶4)接種在孔板上，37 ℃與5% CO2條件下孵育。于3、7、11、14、18、24、30、36、42 h在倒置顯微鏡下觀察小管形成情況并采集圖像。

1.2.4細(xì)胞趨化實驗 DPSC和HUVEC在血清饑餓24 h后，消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×106/ml，上室每孔加0.1 ml HUVEC懸液，下室分別加入0.6 ml的DPSCs或血管周細(xì)胞懸液，所有樣本均設(shè)有復(fù)孔，37 ℃與5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。固定染色鏡檢，計算下表面遷移細(xì)胞數(shù)，評價DPSCs和血管周細(xì)胞對HUVEC遷移行為的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理每次實驗獨立重復(fù)≥3次，采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采取獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPSCs的流式鑒定流式細(xì)胞儀對DPSCs進(jìn)行表面抗原的檢測，結(jié)果顯示細(xì)胞純度較高，均陽性表達(dá)CD105、CD73、CD90、CD29、CD44，陰性表達(dá)CD34、CD45，符合間充質(zhì)來源的干細(xì)胞特征，為間充質(zhì)來源(圖1)。

2.2 DPSCs與血管周細(xì)胞的多向分化潛能在倒置顯微鏡下，DPSCs和血管周細(xì)胞均呈梭形，貼壁生長，兩者表現(xiàn)出類似的形態(tài)學(xué)特征(圖2)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測DPSCs表面標(biāo)志物

圖2 細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察 ×40

DPSCs和血管周細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)4周后，茜素紅染色顯示紅色的礦化結(jié)節(jié)。經(jīng)成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)4周后，觀察到兩組細(xì)胞均縮小變窄并向兩側(cè)伸長，呈長軸突樣，類似神經(jīng)元樣細(xì)胞的形態(tài)。發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞均能向成骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化，可見DPSCs和血管周細(xì)胞均具有相似的多向分化能力(圖3)。

2.3 DPSCs/血管周細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)形成穩(wěn)定的管狀結(jié)構(gòu)本研究進(jìn)行了Matrigel成血管實驗，以HUVEC、DPSCs+HUVEC和血管周細(xì)胞+HUVEC在Matrigel上共培養(yǎng)，比較各組的成血管能力。結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞均可加強由HUVEC形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相互連接，形成管腔樣結(jié)構(gòu)，并維持到42 h。可見DPSCs和血管周細(xì)胞均能增強HUVEC產(chǎn)生的管狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(圖4)。

圖4 體外Matrigel成血管實驗結(jié)果 ×10

2.4 遷移功能DPSCs和血管周細(xì)胞與HUVEC在Transwell孵育12 h后，上室中各實驗組均有一定數(shù)量的HUVEC進(jìn)入下室，表明DPSCs和血管周細(xì)胞對HUVEC均有較強的趨化作用，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

3 討論

血管周細(xì)胞是血管結(jié)構(gòu)的重要組成部分，也稱為壁細(xì)胞，嵌入在小血管、毛細(xì)血管和微血管的基底膜中[5]，在促進(jìn)血管新生方面起著重要的作用，如穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)和刺激血管生成[6]。并且血管周細(xì)胞已被證明可分化為各種譜系，如肌纖維、成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等[7-9]。血管周細(xì)胞的多能分化能力和血管生成潛能使其成為細(xì)胞治療的潛在候選細(xì)胞，但目前血管周細(xì)胞的分離仍然具有挑戰(zhàn)性。2000年，Gronthos et al[10]首次從牙髓組織中成功分離出DPSCs，并進(jìn)一步證明了DPSCs具有自我更新和多向分化的潛能，可以被誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮等多種細(xì)胞類型。研究發(fā)現(xiàn)DPSCs能分泌多種成血管因子，用DPSCs培養(yǎng)液培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力以及成血管能力[11-12]。有學(xué)者對DPSCs進(jìn)行成血管誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)DPSCs可分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞，在體外可形成血管樣結(jié)構(gòu)[13-14]。另外，顱面血管周細(xì)胞和DPSCs均起源于顱神經(jīng)嵴，DPSC的解剖位置和發(fā)育起源與周細(xì)胞相似。Shi et al[15]研究表明，大部分DPSCs表達(dá)血管周細(xì)胞標(biāo)志物3G5，也證實了它們與血管周細(xì)胞的相似性。所有這些證據(jù)提示是不是可以用來源充足、獲取容易的DPSCs作為血管周細(xì)胞的替代物。本研究從臨床上獲得牙髓組織，體外分離培養(yǎng)得到DPSCs，并對細(xì)胞進(jìn)行驗證，流式細(xì)胞儀檢測顯示CD105+、CD73+、CD90+、CD29+、CD44+及CD34-、CD45-，與間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)一致。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面，比較了DPSCs和血管周細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均呈梭形，貼壁生長，形態(tài)無明顯差異。本課題組還研究了兩種細(xì)胞的分化能力，發(fā)現(xiàn)DPSCs和血管周細(xì)胞均能向成骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化。Matrigel膠成血管實驗是一種常應(yīng)用于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的成血管研究的體外模型。本研究在 Matrigel上將血管周細(xì)胞或DPSCs與HUVEC共培養(yǎng)，兩組共培養(yǎng)均觀察到有明顯的血管形成，且維持較長時間，驗證了DPSCs同樣也具有顯著的促成血管能力。在此基礎(chǔ)上，通過Transwell實驗進(jìn)一步研究DPSCs對血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用。Transwell趨化實驗是將被趨化細(xì)胞接種在上室內(nèi)，通過小室底部的通透性膜，下層培養(yǎng)液中的成分可以作用到上室內(nèi)的細(xì)胞，以此研究下層物質(zhì)對細(xì)胞遷移的作用。將HUVEC分別和血管周細(xì)胞、DPSCs兩種細(xì)胞同時培養(yǎng)于 Transwell的上下室，培養(yǎng)12 h后，可以清楚觀察到兩組HUVEC的遷移。初步證明了DPSCs對HUVEC也有顯著的趨化作用。而血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移對于新生血管形成是至關(guān)重要的。

圖5 血管周細(xì)胞和DPSCs對HUVEC遷移行為的影響 ×20

綜上所述，本研究從細(xì)胞分化、趨化和促成血管能力等多個角度，對DPSCs和血管周細(xì)胞進(jìn)行比較，提示DPSCs和周細(xì)胞具有相似的功能，為臨床上DPSCs作為血管周細(xì)胞的替代提供了理論依據(jù)。