MEAM1煙粉虱隱種對3種新煙堿類殺蟲劑交互抗性及交互現實遺傳力的分析

呂歡歡，周成松，楊 柳，劉禎妍，馬德英

(新疆農業大學農學院/農林有害生物監測與安全防控重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】煙粉虱是一個包括多種隱種(cryptic species)的復合種(species complex)，在寄主范圍、傳毒能力、抗藥性等存在差異[1-5]，評估煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑的交互抗性風險，預測其交互抗性發展速率，研究新煙堿類殺蟲劑的減量使用、延緩抗性積累、延長使用壽命，對提高防治效果及科學合理用藥具有重要的參考價值。【前人研究進展】MEAM1型(原B型)和MED型(原Q型)煙粉虱是入侵性最強和為害農作物最嚴重的 2 種煙粉虱隱種，已經入侵到中國大部分區域并逐步取代當地種群，成為主要為害種群[6]。煙粉虱的危害對世界各地經濟造成巨大損失[7]，在1991～1992年煙粉虱就對美國佛羅里達州的番茄產業危害造成1.4×108美元的經濟損失[8]。在中國，2007年煙粉虱在湖北造成的作物損失超過6×108美元[9]；2017年我國江蘇如皋市溫室番茄受煙粉虱危害率高達100%，商品果率不到30%[10]；2011年煙粉虱危害我國新疆吐魯番地區棉田達到該地區棉田總面積的61.23%，目前已不斷擴增蔓延至新疆和田地區、喀什地區等[11-12]。新煙堿類殺蟲劑是煙堿乙酰膽堿受體激動劑，能夠阻斷昆蟲中樞神經系統正常傳導而使害蟲死亡，對包括煙粉虱在內的多種刺吸式口器害蟲均有較好的防治效果[13]。噻蟲嗪、吡蟲啉、啶蟲脒等新煙堿類殺蟲劑市場較多，我國新疆、福建、北京、湖南等多個地區的煙粉虱種群已對該類藥劑產生5.53～71.58倍抗性[14-18]。煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑產生抗性后，也可能對同類型或其他類型的殺蟲劑產生交互抗性，而致使防治效果逐步降低，使其防治難度增加。在室內對南京B型煙粉虱進行15代抗性篩選，發現其對吡蟲啉產生256倍高抗性，并對噻蟲嗪和啶蟲脒分別產生98和49倍的高水平交互抗性[19]。Wang等[20]對煙粉虱使用吡蟲啉篩選30代后，發現該種群對吡蟲啉產生490倍抗性，并對啶蟲脒和噻蟲嗪也產生較高水平交互抗性。對田間種群的監測也發現了交互抗性現象的產生，對西班牙Almeria地區煙粉虱種群進行抗性檢測發現，煙粉虱對吡蟲啉的抗性逐年增強，且與其它新煙堿類殺蟲劑噻蟲嗪和啶蟲脒之間存在交互抗性[21]。而在卡梅爾海岸棉田用噻蟲嗪篩選了12代的煙粉虱種群對啶蟲脒幾乎沒有交互抗性[22]，不同新煙堿類殺蟲劑之間的交互抗性水平和機制可能存在差異。【本研究切入點】通常害蟲產生明顯抗性之前，在室內用該藥劑對害蟲進行抗性篩選來評估其抗性風險，可為該種藥劑在生產上科學、合理的使用、延長藥劑使用壽命和開展預防性抗性治理提供依據[23]。抗藥性風險評估可對環境中應用農藥引起抗性的可能性進行預測，是有害生物抗藥性研究中的重要內容。室內連續多代篩選建立煙粉虱MEAM1隱種的敏感品系、吡蟲啉抗性汰選品系、啶蟲脒抗性汰選品系及噻蟲嗪抗性汰選品系，以這4個品系為研究對象，采用閾狀分析法[24]研究在這3種新煙堿類殺蟲劑長期選擇壓力下，煙粉虱MEAM1隱種對這3種新煙堿類殺蟲劑產生交互抗性的水平及差異。【擬解決的關鍵問題】評估煙粉虱MEAM1隱種對這3種新煙堿類殺蟲劑產生交互抗性的風險，為該類藥劑在煙粉虱的綜合防治及煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑抗性治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 煙粉虱敏感種群

汰選煙粉虱初始種群2009年采自新疆農業大學試驗基地雜草上，采集后由實驗室不接觸任何藥劑繼代飼養，煙粉虱種群純化后經分子生物學鑒定確定為純MEAM1煙粉虱隱種[12]。

1.1.2 煙粉虱抗性種群

在50%～70%選擇壓力下，使用噻蟲嗪、吡蟲啉和啶蟲脒對煙粉虱相對敏感種群進行繼代選育，獲得噻蟲嗪、吡蟲啉、啶蟲脒抗性汰選種群(R-Fn)，如汰選至第9代則稱R-F9。

1.1.3 飼養

MEAM1煙粉虱隱種成蟲在嚴格隔離條件的養蟲室內用非Bt轉基因棉飼養。飼養條件：溫度(25±2)℃，相對濕度50%～60%，光照條件L∶D=16∶8。

由于在不同的選擇壓力下，MEAM1煙粉虱隱種對新煙堿類殺蟲劑交互抗性發展速率不一樣，針對不同的選擇壓力，即新煙堿類殺蟲劑對煙粉虱產生的死亡率為50%、60%、70%、80%、90%和99%時，對抗性提高10倍所需要的代數：G=lg10/(h2S)= lg10/(h2XiXσp)，分別進行預測。

1.1.4 供試藥劑

97% 吡蟲啉原粉(山東聯合化工廠股份有限公司)；98.2% 啶蟲脒原粉(深圳諾普信農業化股份有限公司)；96.0% 噻蟲嗪原粉(深圳諾普信農業化股份有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 生物測定

采用浸葉法[25]檢測MEAM1煙粉虱隱種對3種新煙堿類殺蟲劑的抗性水平。配制1.7%瓊脂溶液加入直徑為40 mm的透氣培養皿中冷卻凝固，將棉花葉片打成直徑為38 mm的葉碟，將殺蟲劑用0.01%的吐溫20稀釋液配置成1 000、100、10、1和0.1 mg/L的濃度梯度，以0.01%的吐溫20稀釋液為對照。將葉碟浸入藥液或對照溶液20 s后取出，于室溫條件下晾干置于凝固的瓊脂表面。將大量羽化后5 d內的雌成蟲于-20℃條件下經冷凍處理30～60 s后放入透氣培養皿中，每個濃度處理3個培養皿，每個培養皿中大約放置30頭左右。當成蟲蘇醒后，記錄每重復試蟲的總數和已經死亡的試蟲(統計有效活蟲數)。將培養皿置于(25±2)℃、光照16L∶8D的培養箱中，48 h后統計死亡率。采用PoloPlus Software Program對試驗數據進行處理分析，獲得致死中濃度LC50(簡稱LC50)。

1.2.2 抗藥性汰選

采用王文卿[25]汰選方法加以改進，根據前一代室內生物測定結果，將噻蟲嗪、吡蟲啉和啶蟲脒分別用0.01%吐溫20配置成殺死種群50%～70% 的劑量，配制1.7%瓊脂溶液加入直徑為40 mm的透氣培養皿中冷卻凝固，將棉花葉片打成直徑為38 mm的葉碟，將葉碟浸入藥液20 s后取出，于室溫條件下晾干置于凝固的瓊脂表面。將煙粉虱成蟲于-20℃條件下經冷凍處理30～ 60 s后放入透氣培養皿中，每個培養皿中大約放置60頭左右，共50個培養皿。將培養皿置于(25±2)℃，光照16L∶8D的養蟲室中培養。48 h后，將培養皿中的活蟲接于實驗室自制養蟲籠內具有5～6枚真葉的健康棉花植株上。每1～2代進行1次毒力測定，監測煙粉虱抗藥性水平。

1.2.3 抗性風險評估和抗性發展預測

抗性現實遺傳力估算采用Tabashnik等的閾性狀分析方法。

h2=R/S，式中：R為被選擇種群的選擇反應，R=log(RR)/n；RR為抗性倍數，n 為代數；

S=iσp，其中S為選擇差數

i=1.583 00-0.019 33P+0.000 04P2+ 3.651 94/P，P為存活率；

σp=1/AS，AS=(初化斜率 + 終代斜率)/2。

根據現實遺傳力h2，可以預測汰選后抗性上升x 倍所需代數Gx=lgx/(h2S)。

2 結果與分析

2.1 MEAM1煙粉虱隱種對新煙堿類殺蟲劑交互抗性

2.1.1 MEAM1煙粉虱隱種吡蟲啉抗性汰選品系對噻蟲嗪和啶蟲脒交互抗性測定

研究表明，使用吡蟲啉連續汰選9代后，供試煙粉虱種群對吡蟲啉的LC50從初始的31.842 mg/L上升到汰選后的1 239.919 mg/L，種群抗性水平升高了38.94倍，對吡蟲啉達到了中等抗性水平；交互抗性測定結果顯示，噻蟲嗪和啶蟲脒對吡蟲啉抗性汰選品系的LC50值分別由59.856和9.92上升到了522.169和190.586 mg/L，交互抗性分別為8.72和19.21倍，抗性水平分別達到了低等交互抗性和中等交互抗性。各交互抗性均呈現逐代上升趨勢，群體交互抗性水平均逐漸增強。表1

2.1.2 MEAM1煙粉虱隱種啶蟲脒抗性汰選品系對吡蟲啉和噻蟲嗪交互抗性測定

研究表明，使用啶蟲脒對MEAMI型煙粉虱隱種進行連續9代汰選，啶蟲脒抗性汰選品系LC50從初始的13.481 mg/L上升到108.799 mg/L，抗性水平升高了8.07倍，對啶蟲脒達到了低等抗性水平；交互抗性測定顯示，吡蟲啉的LC50值由70.552 mg/L上升到711.211 mg/L，交互抗性達到了10.08倍，表現出中等交互抗性水平；噻蟲嗪的LC50值由51.655上升到508.02 mg/L，交互抗性達到9.83倍，表現出低等交互抗性水平。各交互抗性每代抗性倍數均表現出穩定升高，抗性水平均逐漸增強。表2

2.1.3 MEAM1煙粉虱隱種噻蟲嗪抗性汰選品系及其對吡蟲啉和啶蟲脒交互抗性測定

研究表明，噻蟲嗪抗性汰選品系LC50從初始的74.499 mg/L上升到汰選后的490.148 mg/L，抗性水平升高了6.58倍，對噻蟲嗪達到了低等抗性水平；交互抗性測定顯示，吡蟲啉的LC50值由71.880上升到224.388 mg/L，交互抗性達到了3.12倍，處于敏感性下降階段；啶蟲脒的LC50值由12.286上升到38.263 mg/L，交互抗性達到3.11倍，也處于敏感性下降階段；噻蟲嗪抗性汰選品系汰選時抗性上升較緩慢，平均2代出現一次相對明顯的升高，各代交互抗性也呈現出緩慢增長的趨勢。表3

2.2 MEAM1煙粉虱隱種對新煙堿類殺蟲劑交互抗性遺傳力

2.2.1 MEAM1煙粉虱隱種吡蟲啉抗性汰選品系對噻蟲嗪和啶蟲脒交互抗性遺傳力

研究表明，吡蟲啉抗性汰選品系在汰選過程中現實遺傳力平均水平為0.601 2，具有較高的抗性增長速率和較大的現實遺傳力；交互抗性現實遺傳力顯示，在整個測定過程中變化幅度較小，整體表現平穩趨勢，對噻蟲嗪的交互現實遺傳力平均水平為0.198 1，對啶蟲脒交互現實遺傳力平均水平為0.285 4，吡蟲啉抗性汰選品系對啶蟲脒存在的交互抗性風險大于對噻蟲嗪存在的交互抗性風險。表4

表4 煙粉虱隱種(MEAM1)吡蟲啉抗性汰選品系對噻蟲嗪和啶蟲脒的交互抗性遺傳力

2.2.2 MEAM1煙粉虱隱種啶蟲脒抗性汰選品系對吡蟲啉和噻蟲嗪交互抗性遺傳力

研究表明，啶蟲脒抗性汰選品系現實遺傳力變化幅度較小，整體趨勢平穩，現實遺傳力大小平均為0.215 7；交互現實遺傳力顯示，對吡蟲啉交互現實遺傳力大小平均為0.242 3，大于啶蟲脒抗性汰選品系自身現實遺傳力，新疆MEAM1煙粉虱隱種啶蟲脒抗性汰選品系對吡蟲啉存在的交互抗性風險大于啶蟲脒抗性汰選品系單一抗性風險；對噻蟲嗪交互現實遺傳力顯示，在不同篩選階段交互現實遺傳力變化幅度均較小，且交互現實遺傳力較小，平均為0.128 1，在連續篩選的過程中交互抗性增長較小。表5

表5 煙粉虱隱種(MEAM1)啶蟲脒抗性汰選品系對吡蟲啉和噻蟲嗪的交互抗性遺傳力

2.2.3 MEAM1煙粉虱隱種對噻蟲嗪抗性汰選品系及其對吡蟲啉和啶蟲脒交互抗性遺傳力分析

研究表明，噻蟲嗪抗性汰選品系平均現實遺傳力為0.187 4，對吡蟲啉和啶蟲脒交互現實遺傳力大小分別為0.142 1和0.068 0，且汰選各階段交互現實遺傳力變化幅度極小，在連續篩選的過程中抗性增長很小，現階段噻蟲嗪抗性汰選品系對吡蟲啉產生交互抗性的風險大于對啶蟲脒產生交互抗性的風險。表6

表6 煙粉虱隱種(MEAM1)噻蟲嗪抗性汰選品系對吡蟲啉和啶蟲脒的交互抗性遺傳力

2.3 MEAM1煙粉虱隱種對新煙堿類殺蟲劑交互抗性風險評估

研究表明，煙粉虱的單一抗性和交互抗性發展速率都隨藥劑死亡率和現實遺傳力的提高而加快。在死亡率為50%時，MEAM1煙粉虱隱種對新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪單一抗性抗性提高10倍所需代數分別為6、11和15代；交互抗性提高10倍所需代數分別為吡蟲啉抗性汰選品系交互抗啶蟲脒和噻蟲嗪分別為8和11代；啶蟲脒抗性汰選品系交互吡蟲啉和噻蟲嗪分別為10和20代；噻蟲嗪抗性汰選品系交互抗吡蟲啉和啶蟲脒分別為38和40代。圖1

a.吡蟲啉抗性汰選品系 imidacloprid selected strain；b.啶蟲脒抗性汰選品系acetamiprid selected strain；c.噻蟲嗪抗性汰選品系thiamethoxam selected strain)

3 討 論

抗藥性篩選是害蟲抗性風險評估的基礎，昆蟲抗性發展的速度和程度與藥劑類型、藥劑選擇壓力、昆蟲種類及原始種群的抗性水平有關[26]。相同汰選壓下，抗性現實遺傳力越大，害蟲越容易產生抗性[27]。正是由于煙粉虱對藥劑抗性現實遺傳力的差異導致了抗性發展速度的差異。在害蟲抗藥性研究中常常利用親子回歸、同胞分析等方法來研究害蟲抗性遺傳力[28]。采用的閾性狀分析方法只需常規抗性篩選中每代篩選存活率及篩選前后的致死中量和斜率。該方法不僅可廣泛應用，而且還有利于將常規抗性篩選與抗性風險評估相結合，使抗性風險評估得以標準化[29]。為避免田間防治過程中多種殺蟲劑對目標昆蟲的共同選擇以及種群基因交流對種群基因庫的影響，通常需要室內選育抗性種群，并對抗性風險、交互抗性作用和抗性機制等方面探討研究。李國志[17]發現煙粉虱對吡蟲啉產生抗性的風險較高，郭天鳳[30]發現棉蚜對吡蟲啉和啶蟲脒產生一定的抗性風險。試驗發現噻蟲嗪抗性品系交互吡蟲啉和啶蟲脒交互現實遺傳力分別為0.142 1和0.068 0，死亡率為50%時，產生10倍交互抗性所需代數分別為38和40代，均具有較低的交互抗性風險，該結果與王文卿[25]試驗結果一致。各藥劑交互與反交互中，吡蟲啉抗性汰選品系對啶蟲脒和啶蟲脒抗性汰選品系對吡蟲啉的交互現實遺傳力最高，分別為0.285 4和0.242 3，死亡率為50%時，交互抗性提高10倍所需代數分別為8和10代，具有較高的抗性風險；噻蟲嗪抗性汰選品系對啶蟲脒和啶蟲脒抗性汰選品系對噻蟲嗪的交互現實遺傳力最低，分別為0.068 0和0.128 1，死亡率為50%時，交互抗性提高10倍所需代數分別為40和20代，具有較低的抗性風險。煙粉虱對2種殺蟲劑可能存在著不同的抗性機制，有待進一步研究和探索。

4 結 論

在3種新煙堿類殺蟲劑抗性汰選品系中，除啶蟲脒抗性汰選品系交互吡蟲啉的交互抗性風險高于啶蟲脒單一抗性風險外，其余2種藥劑產生交互抗性的風險均低于各藥劑產生單一抗性的風險，通過評估MEAM1煙粉虱對3種新煙堿類殺蟲劑的交互抗性風險，預測煙粉虱對3種新煙堿類殺蟲劑交互抗性的速率。