歐前胡素對腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)損傷及ATP酶活力的影響

趙 康，趙煦萌，邢亞利，張忠霞，邱會卿

中風是一種急性腦血管疾病，由于缺血或出血導致腦供血不足，神經(jīng)元及其連接損失導致腦損傷[1]。目前批準的治療缺血性中風的方法僅限于血管阻塞的快速再通和溶栓藥物的藥理學治療。至今尚無藥物能在中風發(fā)作后立即給藥以減少隨后發(fā)生的神經(jīng)學問題，且有超過50種審計保護劑進入臨床試驗因療效和毒性的問題宣告失敗[2]。中藥在治療中風的用藥歷史中，作為活血化瘀藥、熄風藥和益氣藥。歐前胡素是從白芷、蛇床子等植物中提取分離出來的活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗感染、抗凋亡、改善記憶等藥理作用[3]。已有研究[4]表明歐前胡素通過降低缺血再灌注損傷大鼠模型大鼠腦組織內(nèi)促炎性細胞因子的含量， 減少損傷后的炎癥反應，保護神經(jīng)元，改善腦缺血癥狀。但歐前胡素對中風的具體作用機制仍不清楚。該文旨在研究歐前胡素對腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷及ATP酶活力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只雄性SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，7周齡，體質(zhì)量(210±15)g，許可證號：SYXK(川)2014-189，置于溫控(22±1)℃和光控(200lux，12 h/12 h光暗循環(huán))動物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2 試驗藥物與主要試劑歐前胡素(110826-201616)、尼莫地平(100270-201403)購自北京食品藥品檢定研究院，化學式：C16H14O4，分子量：270.28，含量：99.6%；蘇木精-伊紅染液(D006-1-1)、TTC染液(D025-1-3)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測定試劑盒(A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒(A003-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH)(A005-1-2)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(A020-2-2)、Na+-K+-ATP酶測定試劑盒(A070-2-2)、Ca2+-Mg2+-ATP酶(A070-3-1)購自南京建成生物工程研究所；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C1091)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Anti Survivin(ab469)、Caspase-3(ab13847)、Caspase-9(ab52298)購自美國Abcam公司。

1.3 動物模型建立[5]與分組將大鼠用10%水合氯醛溶液(360 mg/kg)進行麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺，于頸部正中切口剪開，隨機均分為6組：假手術(shù)組、模型組、歐前胡素25、50、100 mg/kg組和尼莫地平組。除假手術(shù)組外，其余各組分離出頸動脈血管，動脈夾夾閉左頸內(nèi)動脈，手術(shù)絲線結(jié)扎左頸總動脈和左頸外動脈近心端，松開動脈夾，左頸總動脈插入線栓，插入深度為18～20 mm，2 h后取出，血管復位后縫合切口，建立腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型。并灌胃歐前胡素(25、50、100 mg/kg)和尼莫地平(20 mg/kg)，連續(xù)14 d，每日灌胃1次。假手術(shù)組和模型組灌胃等量生理鹽水。最后1次灌胃后12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液(360 mg/kg)麻醉，快速斷頭取腦組織，參照大鼠腦立體定位圖譜快速取右側(cè)半球海馬組織置入收集管中, 液氮中保存。

1.4 Y迷宮實驗檢測大鼠學習記憶功能Y迷宮具有3個臂，分為起始臂、新異臂和其他臂。將新異臂用隔板擋住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動10 min，訓練結(jié)束后，大鼠被放回飼養(yǎng)籠。訓練結(jié)束后4 h進行, 抽開新異臂隔板, 大鼠由起始臂放入，在3個臂中自由活動5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只大鼠在各個臂停留的時間和穿梭次數(shù)。統(tǒng)計并分析大鼠在各個臂停留時間占總時間百分比、進入次數(shù)及新異臂潛伏期。

1.5 HE染色將腦組織用10%福爾馬林固定并進行石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅染液，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測。并參照謝淑玲 等[6]腦組織病理評分表進行腦組織病理評分。

1.6 TTC染色按照染液說明書，將新鮮腦組織切片置于裝有TTC染液的培養(yǎng)皿中，37 ℃避光孵育30 min，用組織沖洗應用液將組織表面多余染色液沖洗掉，拍照并觀察樣本顏色變化，切片非梗死區(qū)呈玫瑰紅色，梗死區(qū)組織發(fā)白，紅色區(qū)與灰色區(qū)之前未缺血區(qū)，計算梗死面積比例。

1.7 TUNEL染色將腦組織石蠟切片脫蠟處理，滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20～37 ℃作用20 min，用PBS洗滌3次，加入50 μl TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，用PBS洗滌1次，滴加0.2 ml標記反應終止液，室溫孵育10 min后用PBS洗滌3次，繼續(xù)在樣品上加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min后用PBS洗滌3次，最后滴加0.3 ml DAB顯色液后在熒光顯微鏡下觀測。每張切片隨機選擇10個視野，細胞凋亡率(%)=平均光密度×陽性細胞百分比×100%。

1.8 SOD、MDA、GSH含量測定按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定總SOD含量，采用可見分光光度計測定MDA、GSH含量。SOD在450 nm處測吸光度(optical density, OD)值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

1.9 LDH、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力測定按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶在636 nm處測OD值，LDH在450 nm處測OD值。

1.10 Western blot將各組大鼠腦組織在冰上溶解25 min，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100 ℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入一抗Survivin(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)，4 ℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的IgG(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復3個獨立的實驗。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素對MCAO模型大鼠腦部功能的影響采用Y迷宮實驗檢測各組大鼠腦部功能結(jié)果如表1所示。與假手術(shù)組比較，模型組新異臂進入次數(shù)降低(t=5.066，P<0.05)，新異臂潛伏期、起始臂進入次數(shù)、其他臂進入次數(shù)升高(t=1.265、7.178、3.544，P<0.05)。與MACO模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組新異臂進入次數(shù)升高(F=1.687，P<0.05)，新異臂潛伏期、起始臂進入次數(shù)、其他臂進入次數(shù)降低(F=53.30、0.515 0、4.316，P<0.05)。

表1 歐前胡素對MCAO模型大鼠腦部功能的影響

圖1 歐前胡素對MCAO模型大鼠腦組織病理損傷的影響 HE染色×200

圖2 歐前胡素對大鼠腦梗死面積的影響

2.2 歐前胡素對MCAO模型大鼠腦組織病理損傷的影響采用HE染色檢測各組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學變化結(jié)果(圖1)，并對腦組織進行病理評分(表2)。假手術(shù)組細胞組織紋理清晰，著色均勻。模型組較假手術(shù)組神經(jīng)元細胞萎縮，著色深濃，紋理紊亂，呈現(xiàn)腦組織病理損傷，病理評分升高(t=1.338，P<0.05)。歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組較MCAO模型組病理損傷程度均有改善，病理評分降低(F=17.94，P<0.05)。

2.3 歐前胡素對MCAO模型大鼠腦梗死面積的影響通過TTC染色檢測各組大鼠腦梗死面積結(jié)果如圖2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著升高(t=1.162，P<0.05)。與模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組大鼠腦梗死面積顯著降低(F=15.95,P<0.05)。

表2 歐前胡素對MCAO模型大鼠腦組織病理評分的影響

2.4 歐前胡素對MCAO模型大鼠神經(jīng)元細胞凋亡的影響采用TUNEL染色觀察神經(jīng)元細胞凋亡，結(jié)果如圖3。細胞核呈現(xiàn)黃褐色為陽性細胞，即凋亡細胞。與假手術(shù)組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高(t=1.055，P<0.05)。與模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組細胞凋亡率顯著降低(F=22.73,P<0.05)。

2.5 歐前胡素對MCAO模型大鼠Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白水平的影響Western blot檢測各組大鼠Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平結(jié)果如圖4、表3所示。與假手術(shù)組比較，模型組Survivin蛋白水平降低(t=1.364，P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9蛋白水平升高(t=1.154、1.065，P<0.05)。與模型組相比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組Survivin蛋白水平升高(F=21.56，P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9蛋白水平降低(F=79.42、71.15，P<0.05)。

圖4 Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平

2.6 歐前胡素對MCAO模型大鼠SOD、GSH、MDA含量的影響試劑盒檢測各組大鼠SOD、MDA、GSH含量結(jié)果如表4所示。與假手術(shù)組比較，模型組SOD、GSH含量降低(t=1.959、2.585，P<0.05)，MDA含量升高(t=1.843，P<0.05)。與MCAO模型組相比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組SOD、GSH含量升高(F=11.18、13.37，P<0.05)，MDA含量降低(F=5.364，P<0.05)。

表3 歐前胡素對MCAO模型大鼠Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平的影響

表4 歐前胡素對各組大鼠SOD、MDA、GSH含量的影響

2.7 歐前胡素對MCAO模型大鼠LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的影響試劑盒檢測各組大鼠血清LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力結(jié)果如表5所示。與假手術(shù)組比較，模型組LDH活力升高(t=2.292，P<0.05)，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力降低(t=2.188、3.645，P<0.05)。與模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg和尼莫地平組LDH活力降低(F=26.26，P<0.05)，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力升高(F=19.33、2.701，P<0.05)。

表5 歐前胡素對各組大鼠LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的影響

3 討論

中風為古代中醫(yī)“風、癆、臌、膈”四大難病之首，是以高發(fā)病率、高死亡率和高復發(fā)率等特點嚴重威脅人類健康的一種疾病[7]。中藥以其多途徑多靶點的作用，在中風的治療中取得了療效。歐前胡素是中藥白芷、獨活和當歸中的有效成分，已有研究[8]表明歐前胡素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本實驗通過構(gòu)建MCAO大鼠模型發(fā)現(xiàn)歐前胡素具有改善腦缺血再灌注模型大鼠腦組織病理損傷的作用。

Y迷宮實驗主要研究嚙齒類動物的空間識別記憶能力, 該迷宮利用了嚙齒類動物對新異環(huán)境天然探究的自然習性, 不需要動物學習任何規(guī)則趨利避害，能有效反映動物對新異環(huán)境的識別記憶能力。本研究表明歐前胡素具有改善腦缺血再灌注模型大鼠對新環(huán)境空間認知、行為辨別及記憶能力，提示歐前胡素可增強腦缺血再灌注模型大鼠對新環(huán)境的探索及記憶能力。

凋亡是細胞死亡的抑制，在正常成年組織的早期發(fā)育和生長中起著重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過程中，這是一種常見的現(xiàn)象。然而在成年人的大腦中，神經(jīng)元的存活對人整個生命周期的正常功能來說更為必要。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強的凋亡抑制基因,Survivin通過直接抑制凋亡終末效應酶半胱氨酸天冬酰胺酶Caspase-3 和Caspase-7 活性來阻斷細胞凋亡過程。通過調(diào)控Survivin的表達，可刺激神經(jīng)發(fā)興奮。Caspase-3是多種凋亡途徑最主要的下游效應因子之一，是細胞凋亡的關(guān)鍵酶,在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用,直接參與細胞凋亡的發(fā)生，導致腦缺血再灌注損傷，而活化的Caspase-9可激活Caspase-3。在缺血性神經(jīng)損傷中，抑制Caspase-3、Caspase-9活性可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護作用[9]。Wang et al[10]研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素通過抑制氧糖剝奪/再灌注誘導的人神經(jīng)母細胞瘤細胞模型凋亡保護神經(jīng)元。本研究顯示歐前胡素具有上調(diào)Survivin蛋白水平，下調(diào)Caspase-3、Caspase-9蛋白水平的作用。提示歐前胡素通過抑制神經(jīng)元細胞凋亡改善腦缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)元損傷。

氧化應激在腦缺血再灌注中起到重要作用，由于腦組織代謝旺盛、需氧量高, 導致生成較多的活性氧, 但腦組織自身缺少抗氧化物質(zhì)，導致氧化損傷。MDA是體內(nèi)脂類物質(zhì)遭受自由基攻擊后斷裂形成的氧化產(chǎn)物，其水平高低可反映氧化應激程度[11]；GSH、SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化物酶，可清除細胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS),具有保護細胞免受氧化損傷的作用。He et al[12]研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素通過降低MDA含量使大腦免受腦缺血再灌注引起的過度氧化應激損傷, 進而發(fā)揮腦保護作用。余盈 等[13]研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素通過升高SOD、GSH含量減輕阿爾茨海默病模型小鼠氧化應激損傷。本研究顯示歐前胡素具有升高腦缺血再灌注模型大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用，提示歐前胡素可能通過抗氧化途徑減少神經(jīng)元細胞內(nèi)氧化應激反應，起到治療腦缺血再灌注大鼠的作用。

血清LDH作為評價腦組織損傷的指標，在腦缺血后腦細胞通透性增加，腦組織中LDH活性降低[14]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶參與細胞間及組織間物質(zhì)轉(zhuǎn)運，由于其活性維持依賴于ATP的支持，所以其活性高低可體現(xiàn)細胞能量代謝水平。張祎 等[15]研究發(fā)現(xiàn)泄心湯通過增強Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性保護缺血腦組組織。本研究顯示歐前胡素具有升高腦缺血再灌注大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力，降低LDH活力的作用。提示歐前胡素通過維持細胞滲透壓，細胞正常結(jié)構(gòu)和功能改善腦缺血再灌注大鼠病理損傷。

綜上，歐前胡素對腦缺血再灌注大鼠具有保護作用。通過改善病理損傷、新環(huán)境識別能力，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，抗氧化應激。本文揭示了歐前胡素臨床治療中風的潛力，下一步計劃研究歐前胡素在體外對腦缺血再灌注模型的影響。