SNP單體型分析在單基因病植入前遺傳學檢測中的應用

郝 燕，李欣媛，陳大蔚，章志國，紀冬梅，周 平，魏兆蓮，曹云霞

單基因病即單基因遺傳病，是按照孟德爾方式傳遞的疾病，由單個基因突變引起，涉及到單個核苷酸至整個基因改變，其發病率低，但種類繁多。目前已知的被發現的單基因病有7 000余種，卻只有約超過一半的致病基因被明確[1]。植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing，PGT)是首先對胚胎或卵母細胞行活檢，再通過遺傳學方法進行基因或染色體檢測，經篩選正常的胚胎移植入母方子宮，是一種輔助生殖技術與分子生物學和遺傳學基礎相結合的新的產前診斷技術手段[2]。主要分為3個子類，分別是非整倍體篩查(PGT-A)、單基因病檢測(PGT-M)和染色體結構異常(PGT-SR)[3]。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，約占人類DNA多態性的90%，是染色體源性分析常用標志物[4]。通過對胚胎的SNP位點檢測結合家系SNP連鎖分析，從理論上說可以解決單細胞擴增等位基因脫扣的問題[5]。該研究通過二代測序技術結合SNP單體型分析對17種單基因病進行PGT-M。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年1月～2018年12月夫妻一方或者雙方攜帶致病基因突變，均有先證者或完整家系者納入本研究。本研究的開展已經獲得安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準，納入研究的夫婦均在助孕前簽署PGDPGT知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1家系遺傳學咨詢 針對夫妻雙方生殖中心遺傳門診咨詢結果進行PGT術前評估。從先證者著手，詢問相關病史，分析家系基因報告，繪制家系圖。采集家系外周血進行家系單體型預實驗，遺傳物質可以是外周血、羊水或組織DNA。

1.2.2基于二代測序的家系單體型預實驗 以基因突變為目標區域，在該突變上、下游選擇數十到數百個SNP 位點作為遺傳標記。利用引物設計網站設計引物。經DNA 純化、建庫和高通量測序后，選擇有效SNP位點進行連鎖分析以構建家系單體型。

1.2.3超促排卵、取卵、體外受精、囊胚培養和活檢 通過家系單體型預實驗后，采用本中心常規超促排卵方案(長方案)在女方進行控制性超促排卵。結合B超與性激素監測卵泡發育情況，酌情調整促排卵藥物劑量，當至少有2個優勢卵泡直徑≥18 mm時，予以注射HCG 10 000 IU或者艾澤0.25 mg進行扳機誘發排卵。HCG扳機后34～36 h后行B超引導下經陰道穿刺取卵術。

取卵后2～4 h對成熟MII期卵母細胞進行卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)以排除男方精子對PGT結果的干擾。第2日晨觀察胚胎受精，第3日晨觀察胚胎卵裂，再將正常受精和卵裂的胚胎轉入囊胚培養液中繼續培養，每個培養液滴內放置一個胚胎進行培養。取卵后第5日、第6日觀察囊胚形成情況并詳細對應編號記錄，囊胚質量的分級參考最常用的Gardner評分標準[6]。

囊胚活檢: 取卵后第5～6天的發育到4期的囊胚，將內細胞團置于9點上下位置，活檢3點位置滋養層細胞，3點處透明帶激光打孔(激光脈沖400微秒，強度100%)；待囊胚皺縮，將活檢針(ID 20 μm)吸住少量滋養層細胞(5～10個細胞)，卵子固定針和活檢針慢慢向兩邊拉；對準被拉開的滋養層細胞之間的連接連續發射激光，同時繼續輕輕將囊胚和活檢的滋養層細胞向兩邊拉，直至滋養層細胞與囊胚分離。

1.2.4活檢細胞收集和多重置換擴增 吸2 μl PBS至0.2 ml PCR管中，再將活檢的細胞通過拉制的巴斯德管吸入0.2 ml的PCR管中，短暫離心。同時準備空白對照，即直接在PCR管中放入2 μl PBS。收集的細胞通過多重置換擴增(multiple displacement amplification, MDA)方法——單細胞擴增試劑盒操作指南(REPLI-g Single Cell Kit)進行全基因組擴增，活檢后囊胚通過玻璃化冷凍保存。

1.2.5胚胎植入前單體型分析、植入前遺傳學篩查 經DNA純化、文庫構建、測序行胚胎植入前單體型分析，對于單體型正常的胚胎，進一步行染色體拷貝數分析，主要包括文庫構建、模板制備和富集、測序等幾個步驟。對單體型分析結果同時行Sanger測序驗證。

1.2.6胚胎解凍和胚胎移植 待遺傳學檢測結果出來之后，選擇正常胚胎解凍進行移植。

1.2.7妊娠確定及隨訪 移植后14 d測血HCG陽性者繼續應用黃體支持藥物，待移植后30～35 d B超檢查，若宮內見孕囊，并見胚芽及原始心管搏動者為臨床妊娠，并繼續黃體支持至移植后65 d。若成功妊娠，妊娠中期行羊水穿刺，進行基因檢測，同時了解胎兒發育情況。產后隨訪有無出生缺陷。

2 結果

2.1 患者基本資料以及胚胎發育情況22例患者平均年齡為(31.00±4.79)歲，包括常染色體顯性遺傳病5例，常染色體隱性遺傳病10例，X-連鎖隱性遺傳病7 例。22例患者一共獲卵子421枚，成熟卵子355枚，受精305枚，卵裂301枚，共活檢囊胚143枚。

2.2 PGT檢測結果共構建有效SNP位點數目為2 668個(表1)，其中有20例患者同時行單體型分析和染色體非整倍體篩查，54枚胚胎單體型分析正常，但其中染色體拷貝數正常的胚胎數目僅為32枚，所占比例為59.2%(表2)。有2例患者要求僅行單體型分析，這2例患者獲得可移植胚胎的數目為8枚。活檢的143枚胚胎中未獲診斷的胚胎數為6枚，獲得可移植胚胎的數目為40枚，胚胎診斷率為95.8%。所有單體型分析結果經過一代測序驗證，均一致(表3)。

2.3 胚胎移植臨床妊娠結局這22例患者中，有3例無可移植胚胎，有2例患者尚未移植，移植周期數為17例。移植的17例周期中，臨床妊娠12例，共活產9例嬰兒(其中1例患者分娩2名嬰兒，為單卵雙胎)，隨訪均健康，4例患者繼續妊娠中，臨床妊娠率為70.6%。妊娠的12例患者經羊水穿刺驗證，與PGT結果均一致。

3 討論

單基因病種類繁多，致死及致殘率高，至今尚無有效治療方法。PGT可以在胚胎種植前進行，可有效避免遺傳疾病患兒出生及引產帶來的痛苦。

2017年歐洲人類生殖與胚胎學學會(ESHRE) 報道了71個中心共11 637個PGT取卵周期的數據：其中單基因遺傳病占3 445個周期，所占比例約為30%，呈逐年上升趨勢[7]。單基因遺傳病的PGT方法包括直接診斷和間接診斷。直接診斷即直接檢測突變基因，間接診斷指利用基因內部或周圍的多態性標記間接推斷胚胎是否攜帶致病突變。這些多態性標記通常是一些短串聯重復序列(short tandem repeats, STR)或SNP位點，這些位點常與目標突變位點緊密相連，被稱為單體型，在遺傳時可作為一個整體傳遞給子代，這種間接診斷的連鎖分析方法又稱為植入前遺傳學單體型分析(preimplantation genetic haplotyping, PGH)。采用間接性的植入前遺傳學單體型分析可使等位基因脫扣的影響最小化[8]。 STR-PGH一般選取3～5個相鄰的STR位點，而SNP所能用于連鎖分析的位點通常為400～500個，因此可提供更準確、更全面的信息[9]。

表1 22個家系致病基因、胚胎體外受精及卵裂情況(n)

目前較常用的單基因病PGT方法常采用核型定位分析技術，即Karyomapping技術。該技術通過對先證者和家系成員DNA進行全基因組范圍的SNP分型，根據SNP提供的信息確定每個胚胎染色體的親本來源[10]。該方法主要優點在于無需對某種特定單基因病個體化設計有效SNP位點[10]，其主要缺點是無法直接對目標突變位點進行分析，也無法診斷新發突變，如果先證者DNA缺乏，將限制Karyomapping方法的應用[9]。近年來，二代測序技術(next generation sequencing, NGS)又稱高通量測序技術迅速發展，NGS的測序成本大大降低。該方法可以分析幾乎所有類型的遺傳變異[11]，同時可提供高通量的遺傳分析信息。PGT-M中，基于NGS的PGH方法可實現胚胎基因型和單體型的同時分析。該方法在先證者缺乏的情況下仍可以進行診斷。Treff et al[12]首次將NGS方法應用于囊性纖維化、Walker-Warburg綜合征和神經纖維瘤病的PGT中。本研究采用該方法也獲得了較高的成功率。由于植入前胚胎較高比例非整倍體的存在，本研究對54枚單體型分析正常的胚胎行染色體拷貝數分析，正常的胚胎僅為32枚，所占比例為59.2%，說明了行非整倍體篩查的必要性。病例11中女方為成骨發育不全患者，女方母親亦有類似癥狀。女方為COL1A基因雜合突變攜帶者，男方患有先天性白化病，為OCA2基因純和突變，成骨發育不全在女方家系屬于顯性遺傳模式，而白化病是隱性遺傳模式，因此COL1A必須進行基因診斷，而女方并未攜帶白化病的致病基因突變，子代發生純合或復合雜合的概率極低，因此不必進行OCA2基因的診斷。病例18夫妻雙方均為先天性視力障礙，其中男方為家族性視力障礙，女方無家族史。男方基因檢測提示NHS基因半合子突變，女方為RB1基因雜合突變，女方父母正常并且均不攜帶該突變。本研究采用植入前單體型分析的方法針對胚胎的NHS和RB1基因突變進行了排除，結合染色體拷貝數分析的結果，僅1枚單體型分析正常但染色體為嵌合體的囊胚適合移植，告知相關風險后，夫妻雙方均同意移植該枚胚胎，最終獲得成功妊娠并出生1名健康女嬰。本病例中雖然女方無家族史，但她攜帶的RB1基因突變有可能通過常染色體顯性遺傳的方式遺傳給子代，單體型分析無法通過女方父母和先證者女方構建連鎖關系，所以采用先證者女方和她的胚胎構建SNP單體型，羊水穿刺的結果和單體型分型結果一致，獲得健康嬰兒。病例3為一罕見的神經系統疾病——嬰兒神經軸索營養不良，該病例中女方首次移植1枚染色體和基因單體型均正常的胚胎未獲得成功妊娠，在隨后第2次解凍移植周期中，與患者溝通后，患者同意移植1枚染色體嵌合體、單體型分析正常的胚胎，最終獲得健康嬰兒。嵌合體胚胎指胚胎的組成細胞中存在兩種甚至兩種以上染色體組成不同的細胞系，是早期胚胎發育中常見的現象。相關研究[13]認同分裂后期遲滯和染色體不分離是嵌合體形成的主要機制。囊胚期的嵌合體比例要低于卵裂期，在產前診斷中嵌合現象發生率僅為1%～2%[14]，說明隨著孕周的逐漸增加，嵌合發生的概率也在逐漸下降。相關研究[14]表明約40%的嵌合體可以轉歸為正常胚胎，本研究病例18和病例3移植的染色體嵌合體胚胎獲得成功妊娠，說明嵌合體胚胎有“自我糾正”的能力。

表2 22例患者胚胎單體型/染色體拷貝數正常比較(n)

表3 22例患者活檢、PGT結果和妊娠結局(n)

本研究均為單囊胚移植，妊娠的病例除1例(病例13)發生單卵雙胎外，其余均為單胎。常規PGT治療后要進行孕中期產前診斷，單囊胚移植可避免多胎妊娠造成的產前診斷困難并且在降低多胎妊娠率的同時仍能保持較高的臨床妊娠率。本研究PGT患者均選擇單囊胚解凍移植，其臨床妊娠結局亦證實這點。

本研究結果說明基于NGS的植入前單體型分析方法是切實可行的，可同時進行活檢胚胎的突變位點和單體型的檢測，二者結果可以相互驗證，從而提高結果的準確性。通過植入前遺傳學單體型分析方法可幫助具有高遺傳風險的家庭獲得健康子代，是優生優育的重要手段。