胰腺導(dǎo)管腺癌中KIAA1199基因的表達(dá)及臨床意義

杜少帥，林先盛，黃 強(qiáng)

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是一種預(yù)后極差，且惡性程度極高的惡性腫瘤，5年生存率不足5%[1]，是最具侵略性的腫瘤之一，在西方國家的癌癥相關(guān)死亡中排名第四[2-4]。導(dǎo)致預(yù)后不佳的主要原因之一與它對(duì)胰腺周圍結(jié)構(gòu)的快速侵襲以及發(fā)生淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移有關(guān)。多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，因此也就喪失了外科治療的最佳時(shí)機(jī)。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)診治PDAC極為重要。目前已有多項(xiàng)研究[5]表明KIAA1199基因與多種惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，屬于一種重要的促癌基因，包括胃癌、乳腺癌、口腔鱗癌、前列腺癌和大腸腫瘤等。然而，到目前為止，關(guān)于KIAA1199在PDAC中的表達(dá)情況及其臨床意義的研究甚少。該研究主要通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測KIAA1199基因在人類PDAC組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與腫瘤進(jìn)展及患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系，同時(shí)通過Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測KIAA1199及其mRNA的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究所需臨床病例資料均取自安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院病案室，所需預(yù)后生存期等資料通過隨訪獲得。其中，臨床病例資料包含了60例PDAC患者的性別、年齡、腫瘤位置、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、神經(jīng)周圍浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：男性45例，女性15例；年齡≤60歲有24例，>60歲的有36例；腫瘤位于胰頭處38例，位于胰體尾的22例；組織高分化8例，中低分化52例；TNM分期中Ⅰ+Ⅱ期者47例，Ⅲ+Ⅳ期者13例；發(fā)生神經(jīng)浸潤的24例，無神經(jīng)浸潤36例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例。本研究中預(yù)后等資料則通過患者入院所留聯(lián)系電話進(jìn)行隨訪或者門診隨訪的方式獲得，隨訪時(shí)間截止2019年12月，收集患者的總生存期(overall survival,OS)和無病生存期(disease-free survival, DFS)等資料。自手術(shù)當(dāng)日至患者因該病死亡之間的時(shí)間稱為OS；自患者行根治術(shù)當(dāng)日至患者復(fù)發(fā)PDAC之間的時(shí)間稱為DFS；若患者截止2019年12月仍然存活或者無復(fù)發(fā)，則稱為數(shù)據(jù)刪失。隨訪內(nèi)容包含：患者術(shù)后病史及相關(guān)體格檢查，血清腫瘤標(biāo)志物(CA19-9、CA50、CEA)檢查，腹部增強(qiáng)CT檢查及核磁共振檢查等。同時(shí)，本研究從安徽省肝膽胰重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本庫中選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的新鮮冰凍PDAC組織及相應(yīng)的癌旁組織各10例，用于Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與方法

1.2.1主要試劑 KIAA1199兔抗人多克隆抗體購自武漢Proteintech生物公司；通用山羊抗兔/鼠二抗PV 6000購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒及抗體稀釋液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒及β-actin抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；qRT-PCR引物購自上海生工生物公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色法 打開電烤箱，設(shè)定溫度60 ℃，待烤箱達(dá)到設(shè)定溫度后，將整齊擺放在染色架上的切片放入烤箱中，烘烤30 min左右。從烤箱中取出切片，對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟，用二甲苯脫水，再依次放入濃度為100%、95%、75%的乙醇溶液中進(jìn)行水合，各浸泡5 min后取出。在高壓蒸汽鍋中放置檸檬酸鹽緩沖液，使之浸沒切片，進(jìn)行高壓抗原修復(fù)。自然冷卻后，使用PBS浸洗切片，然后使用3% H2O2溶液孵育切片10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性后，PBS浸洗切片。將KIAA1199和抗體稀釋液按照1 ∶100的比例進(jìn)行稀釋，得到稀釋的兔抗人KIAA1199多克隆抗體，把稀釋后的一抗均勻地滴加在切片組織表面，后置入4 ℃冰箱中過夜孵育，注意不要傾斜導(dǎo)致抗體流失。次日，PBS浸洗切片，滴加二抗，室溫下孵育30～40 min后使用PBS浸洗。配制DAB顯色液，放置載玻片于顯微鏡下，觀察染色并及時(shí)終止。最后，使用蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，樹膠封片，顯微鏡檢查并拍照記錄。

1.2.3免疫印跡法 RIPA試劑盒從PDAC組織和癌旁組織中提取總蛋白，并使用BCA試劑盒確定總蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。每次用TBST洗滌3次，每次5 min，添加二抗(1 ∶5 000),在搖床上于室溫下孵育1 h，然后用TBST洗滌膜3次，每次5 min，使用Image-J軟件分析目標(biāo)蛋白和內(nèi)部參考蛋白的灰度值，根據(jù)目標(biāo)蛋白和內(nèi)部參考的灰度值之比計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol試劑盒從PDAC組織和癌旁組織中分離總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。目標(biāo)基因KIAA1199的引物序列為：(F)5′-AGGCGTGACACTGTCTCGGCTACAG-3′，(R)5′-CCACTCCACGTCTTGAACCCAC-3′；內(nèi)參蛋白β-actin的序列為：(F)5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，(R)5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。設(shè)置反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，設(shè)置40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt法分析表達(dá)水平。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果分析染色結(jié)果判定[6]依據(jù)顯微鏡下可以觀察到黃色或者棕黃色顆粒主要位于PDAC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。最后的評(píng)分通常按染色強(qiáng)弱等級(jí)和染色細(xì)胞陽性百分比兩種方式進(jìn)行。未染色的記為0分，染色淡黃或者陽性細(xì)胞百分比小于10%的記為1分，染色為黃色或者陽性百分比大于10%小于50%的記為2分，染色棕黃或陽性細(xì)胞百分比大于50%的統(tǒng)一記為3分，兩項(xiàng)結(jié)果之和即為總分。最終總分大于3分記為陽性表達(dá)或高表達(dá)。所有切片均由兩位高年資病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片進(jìn)行打分，如產(chǎn)生異議，由兩名醫(yī)師討論分析最后打分。

1.4 隨訪本研究隨訪方式主要為電話隨訪和(或)門診隨訪，隨訪終止時(shí)間為患者因疾病死亡或本研究截止日，隨訪發(fā)現(xiàn)其中失訪患者有2例(1例患者KIAA1199高表達(dá)，另1例患者KIAA1199低表達(dá))，隨訪率為97%。為了研究分析PDAC患者中KIAA1199基因的表達(dá)與患者預(yù)后生存時(shí)間是否有關(guān)系，通過Kaplan-Meier法來繪制患者的生存曲線圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件和Graph Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過Kaplan-Meier方法繪制患者的生存曲線，通過Log-Rank檢驗(yàn)對(duì)組間差異進(jìn)行分析。分類變量使用χ2檢驗(yàn)；定量資料使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIAA1199基因在PDAC組織及癌旁組織中的表達(dá)通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測PDAC組織和癌旁組織中的KIAA1199基因的表達(dá)，結(jié)果顯示：與癌組織(42/60，70%)相比，癌旁組織中KIAA1199基因的表達(dá)較低(5/20，25%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2 KIAA1199基因的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步評(píng)估PDAC患者的臨床特征與組織中KIAA1199表達(dá)之間的相關(guān)性。如表2所示，KIAA1199基因的表達(dá)與PDAC的病理分化程度(P=0.010)、TNM分期(P=0.047)、神經(jīng)浸潤(P=0.016)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與患者的性別(P=0.515)、年齡(P=0.206)、腫瘤位置(P=0.726)并無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表1 KIAA1199在PDAC組織和癌旁組織中的表達(dá)(n)

圖1 KIAA1199在PDAC和癌旁組織中的表達(dá) ×400

表2 KIAA1199的表達(dá)與PDAC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 KIAA1199的表達(dá)與PDAC患者生存期的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析顯示KIAA1199陽性患者的OS中位生存時(shí)間為13.5個(gè)月，陰性表達(dá)的OS中位生存時(shí)間為17個(gè)月；KIAA1199陽性患者DFS中位生存時(shí)間為10個(gè)月，而陰性表達(dá)患者的DFS的中位生存時(shí)間為13.5個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier分析KIAA1199的表達(dá)與OS、DFS的關(guān)系

2.4 Western blot檢測KIAA1199的表達(dá)通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測10對(duì)PDAC組織和癌旁組織中KIAA1199蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，KIAA1199蛋白在PDAC患者組織中較癌旁組織明顯高表達(dá)。其中，KIAA1199在癌組織中的表達(dá)量為(1.130±0.079),在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為(0.501±0.033),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.376，P=0.000 1)，如圖3。

圖3 Western blot 檢測KIAA1199在PDAC和癌旁組織中的表達(dá)

2.5 qRT-PCR檢測KIAA1199的表達(dá)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測KIAA1199在10對(duì)PDAC患者組織和癌旁組織中的mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，PDAC組(9.10±0.55)中KIAA1199 mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組(1.87±0.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.99，P<0.000 1)。

3 討論

PDAC是一種惡性程度高，預(yù)后不良的消化系統(tǒng)腫瘤。目前，盡管PDAC的檢測和治療取得了一些進(jìn)展，但大部分患者確診時(shí)已為晚期，無法進(jìn)行手術(shù)切除。更不幸的是，PDAC對(duì)大多數(shù)化療藥物的反應(yīng)很差。因此，對(duì)胰腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制的研究非常重要。KIAA1199是一種分子量為150 ku的蛋白質(zhì)[7]，位于染色體上KIAA基因群上游15q 25.1的染色體條帶上[8]，編碼包含G8結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的1 361個(gè)氨基酸，該結(jié)構(gòu)域由8個(gè)甘氨酸殘基和5個(gè)β鏈對(duì)組成，G8域的功能未知[9-10]。KIAA1199具有N端信號(hào)肽和信號(hào)肽切割位點(diǎn)，這表明KIAA1199可能具有細(xì)胞外分泌或膜靶向特性。KIAA1199與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，屬于一種促癌基因。Suh et al[11]研究發(fā)現(xiàn)KIAA1199在PDAC細(xì)胞和胰腺癌早期病變(胰腺上皮內(nèi)瘤變)中特異表達(dá)，因此聯(lián)合檢測KIAA1199和CA 19-9可能有助于早期PDAC的篩查。Kohi et al[2]通過敲低siRNA的表達(dá),證實(shí)KIAA1199高表達(dá)提升了胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力。Matsuzaki et al[5]采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測KIAA1199 mRNA的表達(dá)，并從臨床和病理因素的角度分析KIAA1199 mRNA的表達(dá)狀況，進(jìn)行單因素和多因素分析，發(fā)現(xiàn)KIAA1199在胃癌中高表達(dá)，與其預(yù)后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。也有研究[12]證實(shí)KIAA1199在肝細(xì)胞癌中過表達(dá)，不僅促進(jìn)了肝組織上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)這一發(fā)生于腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中的早期事件，更進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床病理癥狀，是肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的標(biāo)志。另有研究[13]發(fā)現(xiàn)KIAA1199可通過PP2A/stathmin通路調(diào)節(jié)破壞大腸癌細(xì)胞微管穩(wěn)定，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，證實(shí)了KIAA1199的過表達(dá)會(huì)加速大腸癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

本研究探討了KIAA1199在PDAC組織中的表達(dá)及其與PDAC患者的臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明，與癌旁組織相比，PDAC組織中KIAA1199表達(dá)上調(diào)。并且KIAA1199的表達(dá)與PDAC患者的TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、神經(jīng)浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素緊密相關(guān)。此外，生存分析也顯示KIAA1199在PDAC組織中的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，表明它可能是PDAC患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。

綜上，該研究認(rèn)為KIAA1199基因在PDAC組織存在高表達(dá)情況，并與PDAC的病理分化程度、TNM分期、神經(jīng)是否浸潤、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移及預(yù)后生存時(shí)間密切相關(guān)。作為單一的較小樣本的回顧性研究，該研究尚存一些不可避免的局限性，還需更完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和進(jìn)一步的前瞻性研究來對(duì)目前的研究成果進(jìn)行補(bǔ)充。總之，該研究證實(shí)KIAA1199基因在PDAC組織存在高表達(dá)情況，并與PDAC患者的臨床病理因素和預(yù)后息息相關(guān)，有望作為預(yù)測PDAC患者腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的有效因子。