復蘇周期中不同發育天數雙囊胚移植臨床結局分析

穆耀琴，丁 丁，魏兆蓮，曹云霞，章志國，周 平

胚胎冷凍技術自1983年首次從人類8細胞期冷凍-解凍胚胎移植中獲得妊娠以來，已經有了快速的發展。隨著囊胚形成率的不斷提高以及冷凍技術的不斷改進，囊胚期玻璃化冷凍-解凍移植已經成為輔助生殖領域的常規技術[1]。目前，盡管單囊胚移植因較低的多胎妊娠率已經成為一種趨勢，但是對于反復種植失敗的患者，雙囊胚移植可以獲得較高的種植率和臨床妊娠率，避免了反復移植失敗產生的心理負擔及高昂的費用,仍然是眾多中心常用的移植方案。該研究通過比較復蘇周期中雙D5、D5+D6以及雙D6三種囊胚移植方案的臨床結局，為改進臨床制定囊胚移植方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2016年1月～2019年10月于安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心行體外受精/卵胞質內單精子顯微注射技術-胚胎移植(invitrofertilization/ intracytoplasmic sperm injection and embro transfer，IVF/ICSI-ET)的患者。共納入2 180個復蘇周期，按照不孕不育因素分為僅男性因素：394個周期；僅女性因素：1 190個周期；男性與女性因素：520個周期；不明原因：76個周期。按照囊胚發育天數以及移植胚胎數分為雙D5組：1 201個周期，；D5+D6組：205個周期,；雙D6組：774個周期。納入標準為：① 年齡≤40歲；② 宮腔形態正常；③ 移植前子宮內膜厚度≥8 mm。排除標準為：① 具有復發性流產史；② 反復種植失敗；③ 子宮內膜疾病；④ 子宮畸形；⑤ 卵巢儲備功能減退。

1.2 囊胚培養采用Blastocyst培養液(美國COOK公司)進行囊胚培養。將發育至D3的胚胎轉移至續胚皿中，待發育至D5、D6時分別根據Gardner評分標準選擇可冷凍的胚胎。

1.3 囊胚冷凍-解凍采用玻璃化冷凍-解凍液(日本KITAZATO公司)按照試劑說明書操作。冷凍前行激光打孔輔助皺縮；冷凍時將囊胚轉移至ES液中平衡5 min，再轉移至VS液，將胚胎置于冷凍載桿并投入液氮，此步驟于1 min內完成。解凍時將胚胎轉移至TS液中1 min；DS液、WS1液WS2液中各3 min，再轉移至胚胎培養皿中，移植前行激光輔助孵化。

1.4 子宮內膜的準備方法自然周期：月經規律者于月經第8～10天B超監測內膜及卵泡生長情況，當卵泡≥12 mm時監測排卵，于排卵后第5天移植囊胚。人工周期：月經不規律者于月經第3天起使用補佳樂或芬嗎通建立內膜，B超監測子宮內膜，當內膜≥8 mm時行肌肉注射黃體酮轉化內膜(黃體酮用量為：每日60 mg)。內膜轉化日算為第0天，第5天移植囊胚。

1.5 臨床結局評價移植后14 d測血清人絨毛膜促性腺激素 (β-human chorionic gonadotropin，β-HCG)，若值大于5 mIU/ml為生化妊娠；移植后30 d B超檢查見孕囊者為臨床妊娠；在宮腔外的部位(如輸卵管)著床者為異位妊娠；妊娠12周以內失敗者為早期流產，B超下見兩個及以上孕囊診斷為多胎妊娠。

2 結果

2.1 玻璃化凍融囊胚復蘇周期基本情況比較本研究共納入2 180個復蘇周期，按照囊胚發育天數以及移植胚胎數分為雙D5組、D5+D6組與雙D6組。對3組間年齡、不同年齡段人群分布、原發/繼發不孕、不孕年限、體質量指數(body mass index，BMI)、基礎促卵泡激素 (follicle-stimulating hormone，FSH) 以及基礎黃體生成素 (luteinizing hormone，LH)方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 玻璃化凍融囊胚復蘇周期妊娠結局比較D5+D6組的生化妊娠率、臨床妊娠率及多胎妊娠率均高于雙D6組(P<0.001)，且低于雙D5組(P<0.001)。雙D5組的早期流產率高于D5+D6組和雙D6組(P>0.05，P<0.05)。D5+D6組的異位妊娠率低于雙D5組和雙D6組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 玻璃化凍融囊胚復蘇周期基本情況比較

表2 玻璃化凍融囊胚復蘇周期妊娠結局比較[n(%)]

3 討論

在輔助生殖領域，選擇囊胚期移植已經成為一種常規方案。近年來，已經有很多報道比較了不同凍融囊胚移植方案的臨床結局，比如D5囊胚的活產率高于D6囊胚[2]，雙D5囊胚移植與雙D6囊胚相比可以獲得更高的種植率與臨床妊娠率[3]。然而目前國內外對D5+D6凍融囊胚移植方案的相關報道十分罕見。李國臻 等[4]通過對1 578個復蘇周期的分析發現D5+D6組的臨床種植率和妊娠率均高于雙D5組和雙D6組(P<0.05)。雖然表明D5+D6囊胚移植是一種有效的方案，但研究并未證實D5+D6囊胚移植的安全性。本文通過比較玻璃化凍融后雙D5、D5+D6與雙D6囊胚移植的臨床結局，證實了復蘇周期中D5+D6囊胚移植方案的有效性和安全性。

本研究顯示雙D5組與D5+D6組的生化妊娠率和臨床妊娠率均高于雙D6組(P<0.001)。分析原因：一方面是胚胎的質量，D5囊胚的質量高于D6囊胚——D6囊胚相對于D5發育速度較慢，胚胎非整倍體率高，開始出現纖維化現象[5]；另一方面是子宮內膜的情況——內膜的厚度、雌孕激素以及血流情況是影響胚胎種植的關鍵因素。如Nazari et al[6]對薄型子宮內膜的患者注入自體富含血小板的血漿后，與對照組相比，生化妊娠率與臨床妊娠率均增加[6]。在本研究中，為了盡量消除內膜的差異性導致數據的不可靠性，已排除了薄型子宮、子宮內膜疾病以及反復種植失敗的患者。但即使有高質量的胚胎和完整的內膜也不一定能種植成功，只有當胚胎發育和子宮內膜同步時才能種植。這種同步性要求在種植窗開放且關閉前的一段時間內移植囊胚，才能提高囊胚種植率。在本中心，無論是D5還是D6囊胚，移植日內膜均為內膜轉化第5天，因此D5囊胚的種植率更高。該研究結果雖然與李國臻 等[4]的研究結果不完全一致，但同樣可以表明D5+D6囊胚移植是一種有效的方案。

盡管雙D5組的生化妊娠率與臨床妊娠率高于D5+D6組，但同時伴隨著更高的多胎妊娠率。多胎妊娠率與囊胚的種植率有直接的關系，種植率越高，臨床妊娠率越高，多胎妊娠率就越高。世界上很多國家已經在提倡減少醫源性造成的多胎妊娠，使醫療資源分配合理化，提高產婦和新生兒健康。醫源性的多胎妊娠不僅對產婦的身體健康造成危害，同時還存在早產兒、低體重兒以及子代殘疾等潛在風險。此外，選擇性減胎術及術后流產、早產等并發癥造成了醫療資源的浪費。因此，單胚胎移植逐漸成為一種趨勢，然而對于高齡、患有內膜疾病以及反復種植失敗的患者，雙囊胚移植仍然是首選方案。雙囊胚移植可以獲得較高的種植率和臨床妊娠率，避免了反復移植失敗產生的心理負擔及高昂的費用,提高了囊胚利用率，縮短了獲得良好的妊娠結局的時間。在本研究中，D5+D6囊胚移植在獲得較滿意的臨床妊娠率的前提下，降低了多胎妊娠率。異位妊娠的發生與薄型子宮、內異癥以及胚胎植入的數量、新鮮移植/冷凍移植有關[7]。本研究已排除了上述因素的影響，結果顯示D5+D6組的異位妊娠率低于雙D5組和雙D6組，但差異無統計學意義(P>0.05)。早期流產率與身體的免疫狀況、內膜的血運、內膜微環境、植入前胚胎的非整倍體率、GnRH扳機當天的血LH水平等多種因素有關[8-9]。本研究結果顯示雙D5組的早期流產率高于D5+D6組與雙D6組(P>0.05，P<0.05)。早期流產率與囊胚發育天數的關系目前尚不清楚，有待進一步研究。根據Sunderam et al[10]的研究，以上結果的分析可以表明D5+D6囊胚移植是一種較安全的方法。

綜上，相比于雙D5與雙D6囊胚移植，D5+D6囊胚移植既可以獲得滿意的臨床妊娠率，又可以降低多胎妊娠率，避免產科并發癥的發生，因此可以作為一種新的移植方案應用于臨床。此外，如何根據囊胚的級別、內膜的厚度、雌孕激素的水平及卵巢儲備功能制定個體化的移植方案，提高輔助生殖助孕的結局，值得進一步的探討與研究。