宮頸癌ING4基因啟動子區甲基化狀態及其臨床意義

陳 艷，牛三強，胡衛平，錢莉莉

宮頸癌(cervical cancer，CC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年估計有50萬例新病例，其中有30萬人死亡[1]。近年來，相關報道表明， CC的發病正在向年輕化方向發展。CC與高危HPV感染有關。研究[2-3]表明，單一的高危HPV感染不足以引起CC，遺傳因素和免疫因素在CC的發展中也起著重要作用。在過去的幾十年中，對癌癥表觀遺傳修飾，特別是DNA甲基化及其對腫瘤致癌作用的研究一直在不斷增加[4]；然而，表觀遺傳因素對CC的影響仍然未知，DNA甲基化經常發生在多種癌癥中，例如結腸癌、乳腺癌和CC[5-7]。盡管認為生長抑制因子4 (growth inhibitory factor 4，ING4)啟動子區的CpG島甲基化是ING4產生的負轉錄調節因子，但尚未在CC中研究此類事件。因此，該研究的目的是評估CC組織中ING4啟動子區甲基化情況與CC發生的臨床意義，并為研究CC的發生和發展提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集安徽省立醫院2018年1月～2019年10月確診的80例CC患者組織標本(CC組)，并以同期在該院治療的子宮良性病變行子宮全切患者的50例標本作為對照組。以上患者均無術前治療及放化療。所有患者均經病理證實。標本收集后保存在-80 ℃直至分析使用。所有患者在收集樣品前均已獲得知情同意。該協議由中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)倫理委員會批準。根據WHO標準對腫瘤的組織學類型和等級進行分類。根據國際婦產科聯合會(FIGO)標準確定每種癌癥的分期。

1.2 方法

1.2.1組織DNA提取和亞硫酸氫鹽處理 按照組織DNA 提取試劑盒步驟獲取組織標本中DNA，并用分光光度儀測定核酸濃度，通過亞硫酸氫鹽處理，DNA的未甲基化胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持未修飾。使用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)對提取的基因組DNA進行修飾。修飾的DNA保存在-80 ℃存儲以備后用。

1.2.2甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP) MSP是使用甲基化或未甲基化DNA的特異性引物對經過亞硫酸氫鹽處理DNA進行PCR擴增，從而得到DNA是否甲基化的信息。通過MSP方法分析所有樣品。同時使用UCSC網站獲取ING4基因上游啟動子序列約1 000 bp，Methprimer進行MSP引物的設計見圖1，引物序列、退火溫度和預期的產物大小見表1。聚合酶鏈反應(PCR)在總體積為20 μl，模板2 μl(200 ng)，10× PCR buffer 2 μl，Mg2+1.6 μl，dNTP mix 0.4 μl，DMSO 0.4 μl，MSP上下游引物(10 pmol/μl,2 μl),HS-Taq酶0.2 μl，滅菌雙蒸水11.4 μl。PCR條件為95 ℃預變性5 min，開始循環，95 ℃變性20 s，使用各引物退火溫度退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環40次，最后72 ℃延伸5 min。反應在PCR儀(G-Storm GSI PCR擴增儀)中進行。使用經過SssI甲基化酶(北京NEB公司)處理后的人外周血DNA作為甲基化陽性DNA對照，該酶甲基化了DNA中CpG二核苷酸的每個胞嘧啶。每個試驗都包括水空白。PCR產物在溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上可視化。僅將未甲基化引物的陽性擴增解釋為未甲基化。將甲基化引物或甲基化和未甲基化引物的正擴增視為甲基化。

1.2.3RNA提取和實時定量逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 根據制造商的說明使用TRIzol(上海玉博生物科技有限公司)提取總RNA。 使用GoScriptTM逆轉錄系統試劑盒(北京Promega生物技術有限公司)從5 μg總RNA中制備cDNA。使用PCR試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)從5 μg cDNA中擴增ING4基因。 循環條件為在94 ℃下預變性3 min，然后進行45輪循環(94 ℃下變性30 s，在57 ℃下進行20 s退火，并在72 ℃下延伸30 s)最后的延伸步驟在72 ℃下進行10 min，并將產品存儲在4 ℃下。ING4引物序列為5′-CACAAGTCCTG AGTATGGGAT-3′(正向)和5′-AGGGATGTGGAAGA AACTGT-3′(反向)，預期大小為295 bp。 GAPDH引物序列為5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTG-3′(正向)和5′-CTGTTGTCGGAGTTCTAGTAG-3′(反向)，預期大小為385 bp。使用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達，并用內源性GAPDH標準化表達數據。所有實時PCR重復3次。

表1 ING4基因MSP引物序列

2 結果

2.1 CC組和對照組臨床病理特征80例CC患者和50例對照組的臨床病理特征見表2。根據現有的留存病理報告，CC組與對照組在年齡、初潮年齡、絕經狀態、妊娠次數、分娩次數、癌癥家族史等方面差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 ING4的異常啟動子甲基化ING4基因的MSP反應的代表性譜帶見圖2。在CC組中，ING4啟動子甲基化率為82.5%(66/80)，在對照組中12.0%(6/50)，CC組中ING4基因啟動子的甲基化率高于對照組(P<0.001)。

2.3 CC組和對照組患者組織標本中ING4基因表達qRT-PCR檢測結果顯示，CC組中ING4 mRNA表達(0.41±0.07)低于對照組中 ING4 mRNA表達(0.87±0.16)(t=22.53，P<0.01)。此外，ING4啟動子區甲基化的CC患者組織中ING4 mRNA水平平(0.37±0.06,n=66)低于ING4啟動子區未甲基化CC患者組織中的ING4 mRNA水平(0.46±0.11,n=14)，差異有統計學意義(t=4.318，P<0.01)。

圖1 ING4基因的MSP引物設計示意圖

表2 CC組和對照組的部分臨床特征

圖2 ING4基因啟動子區部分MSP結果

2.4 ING4高甲基化與CC臨床病理特征的關系根據甲基化狀態，對CC組織中ING4啟動子區域進行多變量分析，結果見表3。ING4啟動子區的甲基化與以下臨床病理特征之間差異無統計學意義：包括年齡、淋巴結轉移、淋巴管侵犯、切緣侵犯、FIGO分期、組織學分型、腫瘤大小和HPV感染(P>0.05)。

3 討論

CC是全球女性中第三大最常被診斷的癌癥，也是第四大導致癌癥死亡的主要原因，并且目前仍然是主要的公共衛生問題[8]。CC的發展是一個多基因、多步驟的癌變過程，涉及復雜的遺傳和表觀遺傳機制。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種常見形式，而通過其啟動子(尤其是CpG島)的超甲基化而沉默，與多種腫瘤的發生有關[5,9]。 Paz et al[9]報道在所分析的70個腫瘤細胞系中，至少每個都存在一個高甲基化基因。 此外，研究表明腫瘤中的癌癥干細胞基因由于甲基化而被下調，例如在膀胱癌[10]、大腸癌[5]和CC[11]。 因此，基因甲基化狀態的改變是參與致癌的關鍵因素之一。

表3 ING4甲基化狀態與CC中臨床病理特征的關系[n(%)]

基因表達的表觀遺傳修飾是環境暴露可能影響疾病的新機制，通過修飾調節基因轉錄的啟動子區域表達。最近，有關表觀遺傳調控機制在CC研究重要性的證據不斷涌現。DNA甲基化模式的改變，尤其是基因啟動子區域的改變，可能對基因表達產生深遠的影響。DNA甲基化的特征是在胞嘧啶-磷酸鳥嘌呤(CpG)島內的胞嘧啶中添加了甲基。未甲基化的CpG島與轉錄活性區有關，而甲基化的DNA募集甲基結合蛋白，這些蛋白促進染色質聚集并阻止轉錄因子的結合。有研究[12]報道，CC中ING4 mRNA 的表達水平明顯低于正常CC旁組織。ING4 可能通過抑制細胞生長，抑制腫瘤血管增生等途徑抑制腫瘤的生長。

ING4是具有249個氨基酸的生長抑制劑(ING4)家族的成員，該氨基酸由位于12q13-31號染色體上的基因編碼。 ING4包含3個核定位信號和1個高度保守的C端植物同源域(PHD)鋅指基序。通過消減雜交篩選，最初將ING鑒定為腫瘤抑制候選物。 ING4在多種細胞過程中起重要作用，包括細胞增殖、細胞周期控制、細胞衰老和凋亡[13-14]。此外，已經證明ING4與組蛋白乙酰轉移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)相互作用以調節基因轉錄。研究[15]表明，ING4與富含A-U的結合元件因子(AUF1)相互作用，從而下調原癌基因MYC。但是，仍需要闡明ING4對癌癥進展的作用的分子機制。本研究檢測了對照組和CC組織標本中ING4基因的甲基化模式。這些數據為本研究提供了一定的證據，CC組織中的ING4甲基化高于對照組，由此推測啟動子區域的DNA甲基化可能影響CC發生過程中的基因激活。

為了驗證ING4產生的表觀遺傳調控的假說，根據MSP狀態評估，ING4啟動子甲基化率為82.5%，對照組中甲基化率為12.0%，本研究表明CC組織中ING4 mRNA基因表達水平明顯低于對照組。且發生甲基化組ING4 mRNA表達較未發生甲基化組低。這些數據表明，ING4基因啟動子高甲基化狀態可能是導致ING4 mRNA表達降低的一個原因，從而影響了CC的發生。盡管沒有在這項研究中調查整個表觀基因組，但很可能多個基因的表觀遺傳修飾參與CC發生發展。

本研究結果顯示ING4基因啟動子區的甲基化與CC患者的年齡、淋巴結狀態、病理學分類和CC的臨床分期等無明顯關聯。但是ING4基因啟動子區甲基化表現出與ING4較低表達的顯著相關性。在后續的研究中，加大樣本量，同時進一步研究更多細胞因子的甲基化狀態，以確定它們的甲基化狀態與CC發生之間的關系。此外，還需要認識到ING4基因在CC的發生、發展和治療反應中所起的關鍵作用。