利川產區顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮成分和抗菌活性研究

李 宇，劉翠君，廖璐婧，郭漢玖，冉亞蘭，劉 丹，羅建群，何美軍*

(1.湖北省農業科學院中藥材研究所，湖北 恩施 445000； 2.恩施土家族苗族自治州農業農村局，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學醫學部，湖北 恩施 445000； 4.恩施硒司令生態農業科技發展有限公司，湖北 恩施 445000)

顯齒蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand. -Mazz.) W. T. Wang，俗名藤茶(vine tea)，屬葡萄科(Vitaceae)、蛇葡萄屬(Ampelopsis Michx)植物，廣泛分布于我國中、南部的山區，其干燥葉和莖經加工后是常見的藥食兩用飲品[1].研究發現顯齒蛇葡萄粗提取物具有抗氧化、消炎、保護肝臟、抗腫瘤、抗酪氨酸酶、抗糖尿病、降血脂等多種生理功效.顯齒蛇葡萄粗提取物能顯著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，能顯著抑制肉制品的硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的升高和羰基化合物的形成，延長肉制品的保質期[2].代謝組表明顯齒蛇葡萄通過參與調節葡萄糖代謝(包括糖異生和糖酵解)，嘌呤代謝和氨基酸代謝等相關途徑，降低小鼠模型的血清葡萄糖和總膽固醇水平[3].有文獻報道顯齒蛇葡萄總黃酮提取物能明顯抑制體外培養的胃癌細胞SGC-7901生長[4].顯齒蛇葡萄粗提取物的單寧餾分組分(主要成分gallotannins) 具有抗氧化活性(清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)和葡萄糖苷酶抑制活性[5].顯齒蛇葡萄總黃酮對原發性高血壓大鼠有明顯的降血壓效果，其潛在的機理是參與調節醛固酮系統與抗氧化系統有關，而且對正常大鼠的血壓沒有影響[6].從葉和莖中分離到的與酸性蛋白結合的雜多糖具有較強的抗氧化活性和葡萄糖苷酶抑制活性[7].顯齒蛇葡萄提取物能改善患血吸蟲病小鼠的肝臟纖維化病理狀況，對患血吸蟲病肝纖維化有明顯治療作用[8].顯齒蛇葡萄的莖葉提取物對D-半乳糖胺導致的大鼠肝損傷具有保護作用[9].

研究發現顯齒蛇葡萄黃酮總含量≥40%，通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatography)、質譜(mass spectrum)和核磁共振(nuclear magnetic resonance)分析鑒定技術發現顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素(dihydromyricetin)含量高達37%[10].二氫楊梅素被證明有多種生理功能：能通過線粒體介導的凋亡途徑誘導人絨毛膜癌細胞(choriocarcinoma cell line JAR)凋亡[11]；能有效減弱增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HPS)的形成[12]；能顯著減輕深度睡眠(deep sleep)導致的空間學習和記憶障礙[13].有文獻報道從顯齒蛇葡萄粗提取物中分離鑒定了5個黃酮苷類化合物：6，7-二羥基-30-甲氧基-40，50-亞甲二氧基異黃酮6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、6，7-二羥基-30-甲氧基-40，50-亞甲二氧基異黃酮 6-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、6，7-二羥基-30-甲氧基-40，50-亞甲二氧基異黃酮 6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基-3′，4′-三羥基黃酮-3-O-6″-鼠李糖、5，7-二羥基-3′，4′-二羥基黃酮-3-O-6″-鼠李糖[14-15].

顯齒蛇葡萄具有多種生理活性，但是關于顯齒蛇葡萄總黃酮的組分、各組分含量、黃酮類化合物的生物合成途徑、及二氫楊梅素積累機制等科學問題，暫無文獻報道.本論文對顯齒蛇葡萄總黃酮組分和抑菌活性進行了全面分析，可為顯齒蛇葡萄在保健食品領域，及食品保鮮領域的充分開發與利用提供理論依據.

1材料與方法

1.1儀器與材料

Bruker maXis高分辨飛行時間質譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀(配DAD檢測器)，Phenomenex 色譜柱(50 mm × 4.6 mm，ODS 5 μm)，imark酶標儀(Bio-Rad美國伯樂)，Agilent Poroshell 反相色譜柱 120 EC-C18(4.6×150 mm，4 μm)，RE-200A旋轉蒸發儀(廣州市星爍儀器有限公司)，Thermo Fisher世爾電導儀(型號：3-star)，HS-GF254硅膠薄層板；J&K色譜純乙腈，黃酮化合物標準品二氫楊梅素、三葉豆苷、山柰酚、楊梅苷(myricitrin)、楊梅素(myricetin)、花旗松素(taxifolin)、槲皮素(quercetin)均購自于阿拉丁試劑公司，其它試劑均為國產分析純.所有供試菌都是中國科學院南海海洋研究所中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室鑒定.顯齒蛇葡萄樣品是從湖北省利川市齊岳山(海拔1 000 m～1 200 m)采集，湖北省農業科學院中藥材研究所高級農藝師由金文鑒定.

LB培養基配制：酵母提取物5 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min(固體LB培養基加入瓊脂20 g·L-1).

MH液體培養基配制：牛肉粉2 g·L-1，可溶性淀粉1.5 g·L-1，酸水解酪蛋白 17.5 g·L-1，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌30 min.

1.2試驗方法

1.2.1顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮提取 干重為5 g的顯齒蛇葡萄嫩葉磨成粉，按料液比1∶50，用250 mL乙醇溶液(60%)浸泡18 h，200 W超聲提取30 min.10 000 r· min-1離心獲得上清液，上清液減壓旋蒸，得到浸膏.

1.2.2顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮提取上清液樣品稀釋10倍備用，高效液相色譜(HPLC)進樣條件：時間0 min～20 min，B相95%～20%，時間20 min～25 min，B相20%～0%，時間25 min ～27 min，B相0%～0%，時間27.1 min～30 min，B相95%～95%.A相：95%H2O、5%甲醇、0.1%乙酸，B相：100%甲醇、0.1%乙酸.MS分析條件：質譜儀器micrOTOF (Q)，離子化模式positive，離子源電壓4 500 V，End Plate Offset -500 V，Dry Heater 180 ℃，Corrector Fill 70 V，Dry Gas 5.0 I·min-1，Reflector 2 107.7 V，Flight Tube 10 000.0 V，Detector TOF 3 250.0 V，Corrector Extract 429.5 V，一級質譜掃描范圍：100～2 000 m·z-1.運用Bruker compass DataAnalysis 4.0數據分析軟件進行質譜數據分析處理，并在中藥成分高分辨質譜數據庫Orbitrap Traditional Chinese Medicine Library (OTCML)檢索分析[16].

1.2.3顯齒蛇葡萄嫩葉各黃酮組分含量測定 利用HPLC外標法[17]測定顯齒蛇葡萄嫩葉各黃酮組分含量，將7個標準品二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素、花旗松素、槲皮素配制成6個濃度梯度(10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、40.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1、160.0 μg·mL-1、320.0 μg·mL-1)的混標，運用1.2.2的HPLC進樣條件測量.測定儀器信噪比(S/N) ，當各標準溶液稀釋至信噪比3

其中，C為顯齒蛇葡萄樣品中黃酮組分含量，n為HPLC檢測濃度，m為顯齒蛇葡萄樣品干重

1.2.4顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮抗菌活性測試 采用濾紙片法[18]測試顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮物對10株供試菌的抑菌活性，取20 μL培養至A600為0.6的測試菌菌液與20 mL LB固體培養基混合均勻倒平板.取15 μL顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮(二甲基亞砜DMSO溶解)，分三次滴加于濾紙片(直徑為6 mm)上，將濾紙片置于混有菌液的培養基上，另設氨芐青霉素(100 mg·mL-1)作陽性對照、添加DMSO作陰性對照，37 ℃培養12 h，測抑菌圈.參照抗生素藥敏標準：高敏(抑菌圈直徑>20 mm)、中敏(10～20 mm)、輕敏或耐藥(<10 mm).采用微量肉湯稀釋法測定顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮對供試菌的MIC值，按美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)M07-A9的標準操作程序：在96孔板上3～12列的每孔加入含總黃酮樣品的MH液體培養基100 μL，設置顯齒蛇葡萄總黃酮終濃度分別為128.0，64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5和0.25 mg·mL-1(3～12列).將培養好的菌液稀釋1 000倍，每孔加入稀釋菌液100 μL，設氨芐青霉素(100 μg·mL-1)作陽性對照，第1列為空白培養基對照，第2列為菌液生長空白對照(加DMSO)，第3～12列為樣品測試列.37 °C培養16 h后使用imark酶標儀檢測A600，根據CLSI M100-S26標準：與陽性生長對照管比較抑制80%細菌生長的藥物濃度為受試菌的MIC值[19-20].

1.2.5數據處理 所有實驗數據運用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，實驗數據以“平均值±標準偏差”表示.P<0.05，表明具有顯著性差異，P<0.01，表明具有極顯著性差異.

2試驗結果與討論

2.1顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮獲得

共獲得250 mL總黃酮提取液，取10 mL加甲醇稀釋10倍，用于顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定和含量檢測.240 mL總黃酮提取液減壓旋蒸共獲得提取浸膏2.026 g，加入4 052 μL DMSO溶解，獲得濃度為0.5 g·mL-1的總黃酮溶液備用.

2.2顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定

運用Bruker Compass DataAnalysis 4.0數據分析軟件，依據黃酮類化合物的UV吸收特征(紫外吸收區域內存在2個主要的峰帶Ⅰ和峰帶Ⅱ)，共從顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分中鑒定出21個類似黃酮類化合物離子峰，進一步在中藥成分高分辨質譜數據庫 (OTCML)檢索計算，共從顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮中鑒定出7個黃酮類化合物(如表1).

表1 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮組分鑒定Tab. 1 Identification of the total flavonoids in the tender leaves of vine tea

注 1)a：mSigma同位素匹配度；

2)b：設定質量標準差≤10 ppm(單位ppm)

運用1.2.2的HPLC進樣條件，HPLC外標法測量7個標準品的標準曲線、重復性、檢出限定量線如表2所示，線性相關性好(R2≥0.9990).每個混標重復測試6次，測得相對標準偏差(S)范圍為0.654 μg·mL-1～0.982 μg·mL-1.

通過配制本底含量標準品濃度溶液，加入定濃度的標準品，HPLC檢測，獲得標準品的加標回收率為98.58%～102.01%，相對標準偏差為1.06%～3.01%，如表3.

表2 標準曲線、重復性及檢測限Tab.2 Regression equation，correlation coefficient and detection limit

注:A為峰面積，單位mAU;y為濃度，單位μg·mL-1.

表3 標準品的回收率(means±SD，n=6)Tab.3 Recovery rate of standard substance

利用HPLC外標法檢測顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮各組分的含量：二氫楊梅素(18.57%)、楊梅苷(0.53%)、楊梅素(1.29%)、花旗松素(1.38%)、槲皮素(0.51%)、三葉豆苷(0.78%)、山柰酚(0.45%)，加標回收率為97.55%～102.51%，相對標準偏差為2.7%～5.80%(如表4).

2.3顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮抗菌活性

利川顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮對蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、溶藻弧菌4株供試菌有中度敏感抑制活性(抑菌圈為11～15 mm)，其MIC值為1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1.對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌2株供試菌有輕度敏感抑制活性(抑菌圈<11 mm)，其MIC值為4.0 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1.顯齒蛇葡萄是重要的藥食同源飲品，其對6株供試菌的抑菌活性功能為開發顯齒蛇葡萄功能性飲品提供了重要參考.

表4 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮各組分含量表( means±SD，n=6)Tab.4 contents of flavones of the totalflavonoids in the tender leaves of vine tea

表5 顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮的抗菌活性( means±SD，n=3)Tab.5 Antibacterial activity of the total flavonoids in the tender leaves of vine tea

續表5

3結 論

通過質譜數據和紫外吸收光譜，從利川顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮中鑒出7個黃酮類組分：二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素、花旗松素、槲皮素、山柰酚、三葉豆苷.利川顯齒蛇葡萄嫩葉總黃酮對蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌有中度敏感抑制活性，推測其良好抑菌活性、廣譜性與各活性黃酮組分的種類、含量密切相關，是多種活性黃酮組分共同作用的結果.已有研究數據表明在顯齒蛇葡萄總黃酮組分中：二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌、多耐銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用；楊梅素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌作用；花旗松素對MRSA有抑菌作用；山柰酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有抑菌作用；楊梅苷對MRSA有抑菌作用[21].富含多種黃酮活性組分的顯齒蛇葡萄總黃酮提取物，具有良好抑菌活性，在植物源綠色抑菌制劑開發領域具有良好的市場前景.