甘草苷對感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的止咳作用機制及抗氧化作用的研究

陳 千，熊富良*，張雪瓊，周煉煉，李心愿，孫雅妮，劉 芮，唐 寒

(1.武漢理工大學化學化工與生命科學學院，武漢 430070； 2.武漢健民中維醫藥有限公司，武漢 430056；3.中南民族大學藥學院，武漢 430074)

沙參麥冬湯為治療肺陰虛類咳嗽的經典名方藥，出自清醫吳鞠通的《溫病條辨》，該復方由北沙參、麥冬、玉竹、天花粉、白扁豆、甘草、桑葉七味中藥材組成；沙參麥冬顆粒是在經典名方沙參湯的基礎上，按照創新藥的要求，應用現代科學技術研制而成的中藥新品種；具有清肺養陰，潤燥生津的功能，臨床用于肺陰虧耗類亞急性與慢性咳嗽的治療.方中北沙參、麥冬為君藥，甘寒生津、清養肺胃；玉竹、天花粉共為臣藥，清肺養陰、潤燥養胃；白扁豆、甘草、桑葉三藥調和合為佐使，培土生津、瀉火和中、散熱散燥；諸藥配伍共奏清養肺胃，生津潤燥之功效，乃甘寒之法[1].現代藥理學研究表明：沙參麥冬湯具有治療干眼癥、咳嗽變異性哮喘、肺陰虛咳嗽、抗腫瘤等功效，尤其是在抗肺癌方面具有很好的開發應用前景[2-6].感染后咳嗽(post infectious cough，PIC)又稱感冒后咳嗽，指各種病原體所致的急性呼吸道感染癥狀消失后，但咳嗽仍遷延不愈的癥狀，通常持續3～8周，常伴有氣道高反應，屬于亞急性咳嗽的一種，為呼吸科門診常見疾病[7-8].但目前無沙參麥冬顆粒治療感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的相關研究，因此本文首次構建感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠模型來深入探討研究沙參麥冬顆粒中甘草苷的止咳療效及抗氧化的作用機制.

本課題在前期實驗研究中，通過構建感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠模型來篩選沙參麥冬顆粒的止咳活性部位，研究結果表明該復方的乙酸乙酯部位浸膏具有較好的止咳作用，進而深入研究其止咳活性物質基礎，采用反復硅膠柱色譜法、半制備高效液相色譜法等多種色譜分離技術對乙酸乙酯部位浸膏進行分離純化，并結合理化性質、核磁、質譜等鑒定手段對分離所得的12個化合物進行結構鑒定，其中包括甘草苷.甘草具有補脾益氣、清熱止咳、抗炎、抗氧化等功效，是我國重要的傳統中藥，在中醫上被尊稱為“國老”，甘草苷為甘草的黃酮類成分，亦具有抗炎、止咳等生物活性[9-10].因此，提示甘草苷可能為沙參麥冬顆粒治療感染后咳嗽(肺陰虛證)的重要止咳活性物質，然而甘草苷的止咳及抗氧化作用的具體機制尚不清楚，本實驗旨在進一步探討甘草苷是否通過減少炎性細胞的浸潤、炎性細胞因子、炎性介質的釋放及表達，進而減少氣道炎性反應環境，降低咳嗽高敏感性來達到止咳的效果；是否通過提高肺組織的抗氧化酶(SOD、CAT)的活性來清除過量的活性氧自由基，減少過量的自由基在體內堆積以達到抗氧化的作用；為沙參麥冬顆粒臨床上治療肺陰虛類亞急性咳嗽提供客觀科學依據.

1材料與方法

1.1實驗動物

Balb/c小鼠(SPF級)，體質量16～24 g，雌鼠(60只)，由華中農業大學提供，實驗動物許可證號SCXK(鄂)2015-0019.

1.2藥品與試劑

北沙參、麥冬、玉竹、天花粉、白扁豆、甘草、桑葉均購于安徽敬道藥業有限公司，并嚴格按照中國藥典的要求鑒定藥材，均為合格藥材.紅金龍香煙(湖北中煙工業有限責任公司，焦油量、煙氣煙堿量、煙氣一氧化碳量分別為10、1、12 mg)；煙熏箱(捷貝有限公司，透明型，長、寬、高分別為72、53、44 cm)；甲狀腺片(山東省惠諾藥業有限公司)；內毒素(上海源葉生物科技有限公司)；辣椒素(成都瑞芬思生物科技有限公司)；孟魯司特鈉片(杭州默沙東制藥有限公司)；甘草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司)；4%多聚甲醛(武漢賽維爾生物科技有限公司)；HE染色液(武漢賽維爾生物科技有限公司)；生理鹽水(武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司)；中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)；小鼠TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE、SOD、CAT、MDA等進口ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司).

1.3實驗儀器

多功能誘咳引喘儀(上海欣軟信息科技有限公司)；微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；JJ-12J型脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016型病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；Nikon Eclipse E100型正置光學顯微鏡(日本尼康)；電熱恒溫培養箱(武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司)；HT-111B型恒溫搖床(上海赫田科學儀器有限公司)；XB220A型電子分析天平(瑞士普瑞賽斯)；JY98-IIIN型細胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；低溫高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；RT-6100全自動酶標儀(美國雷杜).

1.4實驗方法

1.4.1小鼠造模與給藥 適應性飼養5 d后，開始造模.其中空白組(10只)不作任何處理，自由飲水進食；余下50只小鼠，每次煙熏時，將其先放入自制的兩個煙熏箱中(25只小鼠·箱-1)，箱子右上角放置一艾灸盒，第1～10 d上下午分別點燃4支香煙放入艾灸盒中的衛生紙上，蓋上蓋子，其上再以毛巾覆蓋，防止煙霧溢出，30 min后取出小鼠，2次·d-1，持續10 d；第11、14、17 d上午以濃度為0.4 mg·mL-1的LPS滴鼻，按10 μL·10g-1體重計算滴鼻量；第11～19 d下午以濃度為30 mg·mL-1的甲狀腺素混懸液灌胃，每只小鼠的灌胃劑量為0.3 mL；并分別于第12、13、15、16、18、19 d晚上以濃度為1×10-4mol·L-1的辣椒素霧化誘咳，每次霧化時間為3 min，1次·d-1.于造模第20 d，使用多功能誘咳引喘儀對造模小鼠進行辣椒素誘咳激發實驗，若小鼠頻繁噴嚏、頸部伸向前、腹肌抽搐、張口等特征性體位出現，且3 min內咳嗽次數約10次左右，即提示造模成功[7].

造模成功后，隨機分為模型組、陽性組、甘低組、甘中組、甘高組；空白組和模型組均給予等量的生理鹽水灌胃，陽性組給予1.2 mg·kg-1的孟魯司特鈉混懸液(混懸在0.5%CMC-Na中)灌胃，甘草苷低、中、高組分別給予25、50、100 mg·kg-1的甘草苷混懸液(同上)灌胃，每組10只；各組灌胃劑量均為0.1 ml·10 g-1體質量，1次·d-1，連續給藥7 d.

1.4.2小鼠行為學觀察與體質量監測 仔細觀察每組小鼠在造模前后的皮毛光澤、有無脫毛、大便干濕狀態、自由活動狀態、精神狀況以及有無哮鳴音等.

適應性飼養完畢后，在造模期間第1 d測一次體質量作為基礎值，煙熏期間每10 d測一次體質量，煙熏后每5 d測一次體質量，造模完畢后，給藥第7 d再測一次體質量，記錄好實驗數據，觀察各組小鼠的體質量變化.

1.4.3小鼠咳嗽敏感性測定 末次給藥24 h后，取1×10-4mol·L-1的辣椒素溶液作為誘咳液，加入多功能誘咳引喘儀的霧化器中，霧化3 min，霧化停止后再觀察2 min，記錄各組小鼠在5 min內的首咳時間及咳嗽次數.

1.4.4小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量測定 咳嗽敏感性測定完畢后，采用眼球取血法收集各組小鼠的外周全血，將收集好的全血標本放入低溫高速冷凍離心機中，設置離心條件為低溫4 ℃、4 500 r·min-1、離心25 min，離心完畢后取其上清液即為小鼠血清，將小鼠血清置于-20 ℃下凍存.采用ELISA法測定各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量，操作過程及方法均嚴格按照試劑盒說明書進行.

1.4.5小鼠肺組織病理學觀察 各組小鼠眼球取血完畢后，立即解剖取出部分肺組織放入4%多聚甲醛中固定，常規取材脫水后，石蠟包埋切片，并用HE染色液染色.脫水封片后用光學顯微鏡觀察支氣管及肺組織炎性細胞浸潤情況，支氣管黏膜上皮細胞和肺泡壁損害情況等病理變化.

1.4.6小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA的水平含量測定 各組小鼠眼球取血完畢后，立即取出部分肺組織放入凍存管中于-20 ℃下凍存.用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)沖洗肺組織，除去其殘留血液，稱重后將肺組織剪碎.將剪碎的肺組織與對應體積的PBS緩沖液加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨，以制備10%的肺組織勻漿，最后將勻漿液于5000×g條件下離心10 min，取其上清液檢測.采用ELISA法檢測各組小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA的水平含量，操作過程及方法均嚴格按照試劑盒說明書進行.

2結果與分析

2.1甘草苷對小鼠行為學及體質量的影響

在造模期間，空白組小鼠不受影響，小鼠性格溫順，毛發光澤，反應靈敏，進食主動，無哮鳴音；與空白組比較，模型組小鼠膽小易驚，毛發枯黃無光澤、易脫毛，肌肉松弛，大便稀溏，不喜進食，倦怠蜷臥，有哮鳴音；其他各組小鼠狀態與模型組小鼠無明顯差異.在給藥期間，空白組小鼠的精神活動狀態較造模期無明顯變化；模型組小鼠的精神活動狀態較造模期亦無明顯變化；與模型組比較，陽性組及甘草苷低、中、高組小鼠的精神活動狀態均有所好轉，小鼠反應能力均逐漸靈敏輕快，肌肉逐漸緊實，毛發逐漸有光澤，亦逐漸喜主動進食.

由表1可知，在造模期間，空白組小鼠不受影響，其體質量穩健增長；與空白組比較，其他各組小鼠體質量均逐漸明顯下降，差異均具有極其顯著性統計學意義(P<0.001).在給藥期間，空白組小鼠體質量依舊穩健增長；與空白組比較，模型組小鼠體質量回升緩慢，差異具有顯著性統計學意義(P<0.01)；其他給藥組小鼠的體質量均逐漸回歸正常水平，且差異均無統計學意義.與模型組比較，其他給藥組小鼠的體質量均逐漸回歸正常水平，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01).結果表明：采用煙熏+LPS滴鼻+甲狀腺素灌胃+辣椒素誘咳能引起小鼠體質量的明顯減輕，成功模擬了肺陰虛證形體消瘦的病理生理特征；甘草苷低、中、高劑量組均可改善小鼠的精神活動狀態并有效治療小鼠的肺陰虛病征.

表1 各組小鼠體質量變化(n=10)Tab.1 Changes of body mass in each group (n=10)

2.2甘草苷對小鼠咳嗽敏感性的影響

由表2可知，各組小鼠經辣椒素霧化誘咳后，均有不同程度的咳嗽.空白組小鼠的咳嗽潛伏期較長，并出現少量咳嗽；模型組、其他給藥組小鼠的咳嗽潛伏期及咳嗽次數呈不同程度的縮短和增多.與空白組比較，模型組、陽性組、甘低組、甘中組小鼠的咳嗽潛伏期均不同程度的明顯縮短，差異均具有顯著性統計學意義(P<0.01或P<0.001)；甘高組小鼠的咳嗽潛伏期稍有縮短，但差異無統計學意義；模型組、陽性組、甘低組、甘中組、甘高組小鼠的咳嗽次數均不同程度的明顯增多，差異均具有極其顯著性統計學意義(P<0.001).與模型組比較，陽性組、甘中組、甘高組小鼠的咳嗽潛伏期均不同程度的明顯延長，差異均具有極其顯著性統計學意義(P<0.001)；甘低組小鼠的咳嗽潛伏期稍有延長，但差異無統計學意義；陽性組、甘低組、甘中組、甘高組小鼠的咳嗽次數均不同程度的明顯減少，差異均具有極其顯著性統計學意義(P<0.001).結果表明：甘草苷中、高劑量組可明顯延長感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽潛伏期；甘草苷低、中、高劑量組可明顯減少感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽次數；甘草苷可呈劑量依賴性降低感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽高敏感性，以達到養陰止咳的目的.

表2 各組小鼠咳嗽敏感性測定Tab.2 Determination of cough sensitivity in each group

2.3甘草苷對小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量的影響

由表3、表4可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE

水平含量均顯著增高，差異均具有極其顯著性統計學意義(P<0.001)；陽性組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、IgE水平含量稍有增高，TGF-β1水平含量稍有降低，但差異均無統計學意義；甘低組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均增高較多，差異均具有顯著性統計學意義(P<0.01或P<0.001)；甘中組小鼠血清中TNF-α水平含量增高較多，差異具有極其顯著性統計學意義(P<0.001)，IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量有所增高，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；甘高組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2水平含量有所增高，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，TGF-β1、IgE水平含量稍有增高，但差異均無統計學意義.與模型組比較，陽性組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均顯著降低，差異均具有顯著性統計學意義(P<0.01或P<0.001)；甘低組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、IgE水平含量有所降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)，TLR2、TGF-β1水平含量稍有降低，但差異均無統計學意義；甘中組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均降低較多，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；甘高組小鼠血清中TNF-α、IL-13、IgE水平含量均顯著降低，差異均具有極其顯著性統計學意義(P<0.001)，IL-6、TLR2、TGF-β1水平含量均降低較多，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01).結果表明：甘草苷可呈劑量依賴性減少小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量.

2.4甘草苷對肺組織病理變化的影響

由圖1可知，空白組小鼠肺組織基本正常；模型組小鼠肺組織的肺泡壁薄，可見輕微增厚，黑色箭頭周圍可見少量炎性細胞浸潤；陽性組、甘低組、甘中組、甘高組小鼠肺組織的肺泡壁、支氣管等結構較清晰完整，上皮細胞形態較正常，肺泡壁較薄，未見明顯增厚，未見明顯炎癥反應，與空白組小鼠肺組織無明顯差異.結果表明：甘草苷可有效減輕感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠肺組織中的炎癥反應.

表3 小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13水平含量的測定(n=5)Tab.3 Determination of TNF-α，IL-6 and IL-13 levels in serum of mice (n=5)

續表3

表4 小鼠血清中TLR2、TGF-β1、IgE水平含量的測定(n=5)Tab.4 Determination of TLR2，TGF-β1 and IgE levels in serum of mice (n=5)

A) 空白組；B) 模型組；C) 陽性組；D) 甘低組；E) 甘中組；F) 甘高組；A)～F) HE×200，標尺線長度為100 μmA) Control group; B) Model group; C) Positive group; D) Glycyrrhizin low-dose group; E) Glycyrrhizin median-dose group; F) Glycyrrhizin high-dose group; A)-F) HE×200;scale bar：100 μm圖1 各組小鼠肺組織病理變化Fig.1 Pathological changes of lung tissue in mice

2.5甘草苷對小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA水平含量的影響

由表5可知，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均顯著下降，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，MDA水平含量顯著升高，差異具有極其顯著性統計學意義(P<0.001)；陽性組小鼠肺組織中SOD水平含量稍有下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，CAT、MDA水平含量稍有下降，但差異均無統計學意義；甘低組、甘中組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均有所下降，但差異均無統計學意義，MDA水平含量均有所升高，但差異均具有極其顯著性統計學意義(P<0.001)；甘高組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均稍有下降，MDA水平含量稍有升高，但差異均無統計學意義.與模型組比較，陽性組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均明顯升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)，MDA水平含量顯著下降，差異具有極其顯著性統計學意義(P<0.001)；甘低組、甘中組小鼠肺組織中SOD水平含量均有所上升，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，CAT水平含量均稍有上升，但差異均無統計學意義，MDA水平含量均有所下降，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；甘高組小鼠肺組織中SOD水平含量有所上升，差異具有統計學意義(P<0.05)，CAT水平含量有所上升，但差異無統計學意義，MDA水平含量顯著下降，差異具有極其顯著性統計學意義(P<0.001).結果表明：甘草苷可有效增高小鼠肺組織中SOD的水平含量，并呈一定劑量依賴性降低小鼠肺組織中MDA的水平含量.

表5 小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA水平含量的測定(n=5)Tab.5 Determination of SOD，CAT and MDA levels in lung tissues of mice(n=5)

3討論

目前關于肺陰虛慢性咳嗽動物模型的建立方法，主要以煙熏(SO2熏)+甲狀腺素灌胃+利血平灌胃為主[11-12]；感染后咳嗽動物模型的建立方法，主要以煙熏+LPS滴鼻+辣椒素霧化為主[13]；病征結合模型即感染后咳嗽(肺陰虛證)大鼠模型的建立方法為煙熏+LPS滴鼻+甲狀腺素灌胃+辣椒素霧化[7]，但無感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠模型的建立方法，參考感染后咳嗽(肺陰虛證)大鼠模型的建立方法，該模型小鼠的建立方法依舊為煙熏+LPS滴鼻+甲狀腺素灌胃+辣椒素霧化，但通過調整煙熏香煙的支數、LPS滴鼻的劑量以及甲狀腺素灌胃的劑量來構建.故本研究先采用紙煙煙熏法誘導小鼠形成氣道高反應，然后用LPS滴鼻誘導小鼠氣道產生炎性反應、釋放炎性介質，再灌服甲狀腺素使之陰虛燥熱、形體消瘦、灼傷陰津，最后定期用辣椒素霧化誘導小鼠咳嗽，復制出感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的病征結合動物模型.

研究表明，有多種炎性細胞、炎性介質及細胞因子參與形成氣道炎性反應，如TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE等表達增加.TNF-α是細胞因子調節網絡的啟動因子，為主要由巨噬細胞分泌的一類肽類炎性介質，可有效激活中性粒細胞、淋巴細胞、白介素等一系列細胞因子及炎性介質的產生，使氣道產生炎性環境，啟動肺組織炎性反應，產生細胞因子的瀑布效應[14]；IL-6為主要由活化的T細胞和成纖維細胞產生的一種多效細胞炎癥因子，可介導炎性反應效應而加劇炎癥瀑布反應[15]；IL-13為由2型輔助型淋巴細胞(Th2細胞)產生的一種多效細胞炎癥因子，可誘導B細胞的增殖及合成IgE類受體，具有促進氣道上皮細胞產生表達嗜酸性粒細胞趨化因子作用，進而加劇氣道炎性環境[16]；Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)最早發現于果蠅體內，TLRs家族是介導炎癥反應的關鍵受體蛋白，TLR2是TRLs家族中研究最早分布最廣泛的成員，受到內外源性配體刺激后，可通過刺激觸發骨髓分化因子88依賴性信號傳導來激活核轉錄因子(NF-κB)，NF-κB活化后可進一步啟動TNF-α、IL-1、IL-8等一系列炎性細胞因子的釋放表達，來參與各種炎癥疾病過程[17].TGF-β1為一種多功能的細胞因子，是一種強有力的促成纖維細胞分裂因子，可使肺成纖維細胞發生過度增殖和分化，進而趨化炎性細胞和單核巨噬細胞，并促進其合成釋放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細胞因子，來參與炎癥反應[14，18].IgE主要通過激活肥大細胞來改變氣道反應性，并參與介導變應性炎性反應，使氣道平滑肌呈易激性、易痙攣狀態，進而誘發氣道高反應性的形成，同時可引起氣道滲出增加、上皮損傷等其它氣道炎性反應的發生，進一步加劇氣道高反應性及咳嗽高敏感性[7].健康人體內不會過多積累自由基，如果體內抗氧化平衡系統遭到破壞，則體內會堆積過量自由基，進而引發一系列過氧化反應，加速衰老；抗氧化酶是抗氧化系統中不可或缺的重要組成部分，可有效清除機體內過量的活性氧自由基、活性氧類、過氧化物的生成，保護機體免受自由基損傷從而延緩衰老；SOD、CAT均是體內至關重要的抗氧化劑，SOD是機體抵抗氧化損傷的重要保護屏障之一，可有效促進自由基的清除，CAT可有效分解機體內的過氧化氫(H2O2)，釋放新生態氧氣，進而在體內起到解毒及保護巰基的作用；MDA是脂質過氧化的代謝產物，其含量高低與脂質過氧化反應呈正向，可直接反映機體的脂質過氧化水平，代表著組織氧化損傷程度[19-20].

綜上所述，3種不同濃度的甘草苷均可有效減少感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽次數，其中甘草苷中、高劑量組可有效延長小鼠的咳嗽潛伏期，降低其氣道高敏感性；其作用機制可能為減少小鼠氣道中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE等細胞因子及炎性介質的釋放，進而減輕氣道感染性及變態性炎性反應環境來降低咳嗽高敏感性，減少對咳嗽中樞的刺激來達到止咳的目的.3種不同濃度的甘草苷均可有效提高小鼠肺組織中SOD的含量，減少小鼠肺組織中MDA的含量，來改善體內抗氧化平衡系統的紊亂，有效清除機體中的過量自由基，提高機體內抗氧化酶的含量，以減輕氧化損傷來達到抗氧化的目的.