臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內(nèi)注射對(duì)兔VX2 腫瘤低氧誘導(dǎo)因子-1α、 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)及微血管密度形成的影響

羅 榮， 王凌霄， 劉 航， 楊朝愛， 江 旭， 楊繼金

臭 氧 又 稱“活 性 氧”,Sweet 等［1］1980 年 研 究 發(fā)現(xiàn)它在一定濃度范圍內(nèi)可選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響或影響輕微。 研究表明臭氧具有極強(qiáng)的氧化性,可改善腫瘤缺氧狀態(tài),其效果與腫瘤內(nèi)基礎(chǔ)氧分壓呈負(fù)相關(guān),腫瘤內(nèi)氧分壓低于5 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）時(shí)效果最佳［2-3］。 魏強(qiáng)等［4］在瘤內(nèi)注射臭氧致瘤組織超微結(jié)構(gòu)改變的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),一定濃度臭氧可對(duì)腫瘤細(xì)胞及瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。 然而目前關(guān)于臭氧治療腫瘤時(shí)對(duì)腫瘤內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）及微血管密度（MVD）影響的研究報(bào)道較少。本研究對(duì)此進(jìn)行探討,現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性新西蘭大白兔90 只,體重2～2.5 kg,由海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)研究所提供,動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK（滬）20150005；飼養(yǎng)條件為單籠單兔,自由攝食,室內(nèi)溫度（22±2）℃,濕度（70±5）%,每天12 h（7∶00～19∶00）光照。

1.2 兔VX2 腫瘤模型制備

兔適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d 后種植VX2 腫瘤:VX2瘤株來自第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科傳代瘤兔,自傳代瘤兔左后腿取出后于0.9%氯化鈉溶液中洗滌2～3 次,去除表面血漬,無(wú)菌手術(shù)刀切開瘤塊,去除中心壞死部分,取邊緣?mèng)~肉樣組織作為活性腫瘤組織, 無(wú)菌眼科剪將活性腫瘤組織剪碎,大小約為1 mm3,備用；用3%戊硫代巴比妥鈉（0.8～1 mL/kg）沿兔耳緣靜脈緩慢注入進(jìn)行麻醉,兔仰臥位固定于專用手術(shù)臺(tái)上,于左后腿內(nèi)側(cè)肌肉處備皮、消毒、鋪巾后,用無(wú)齒鑷提起皮膚、剪一長(zhǎng)約5 mm 小口,鈍性逐層分離皮下筋膜,暴露皮下肌肉組織, 再用無(wú)齒鑷提起肌肉, 剪一長(zhǎng)約5 mm 小口,將備用瘤塊置入肌肉傷口內(nèi),縫合肌肉和皮膚后消毒并放入籠中飼養(yǎng)。 10～12 d 后,超聲檢測(cè)腫瘤大小,腫瘤長(zhǎng)徑長(zhǎng)至1～1.5 cm 時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 臭氧化0.9%氯化鈉溶液制備

實(shí)驗(yàn)前24 h 將所需0.9%氯化鈉溶液（無(wú)菌透明玻璃瓶?jī)?chǔ)存,劑量30 mL）置于4℃冰箱保存,實(shí)驗(yàn)開始前0.5 h 制作臭氧化0.9%氯化鈉溶液時(shí)取出；將臭氧發(fā)生器輸出濃度調(diào)至20 μg/mL,臭氧氣體輸出速率為3 L/min,通過輸液管道通入備用0.9%氯化鈉溶液中,持續(xù)時(shí)間為20 min。 制作至實(shí)驗(yàn)結(jié)束過程中玻璃瓶周圍仍放置多個(gè)冰袋維持其低溫狀態(tài),制作完成后用臭氧濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)水中臭氧濃度。本實(shí)驗(yàn)所用臭氧化0.9%氯化鈉溶液中臭氧濃度為0.25～0.5 mg/L。

1.4 動(dòng)物分組與處理方法

選擇符合條件的瘤兔72 只,隨機(jī)均分為4 組（A、B、C、D 組）,各18 只。 按上述方法麻醉后,聚維酮碘消毒腫瘤部位,超聲檢測(cè)腫瘤大小,記錄腫瘤最大切面長(zhǎng)徑（a）和相垂直的短徑（b）,按公式V＝1/2ab2計(jì)算腫瘤體積。超聲導(dǎo)引下,A 組注射2 倍腫瘤體積的0.9%氯化鈉溶液1 次、B 組注射2 倍腫瘤體積的臭氧化0.9%氯化鈉溶液1 次、C 組注射2 倍腫瘤體積的臭氧化0.9%氯化鈉溶液連續(xù)2 次（1 次/d, 連續(xù)2 d）、D 組注射2 倍腫瘤體積的臭氧化0.9%氯化鈉溶液連續(xù)3 次（1 次/d,連續(xù)3 d）,緩慢推注,避免腫瘤內(nèi)壓力過大脹破腫瘤包膜,同時(shí)禁忌反復(fù)穿刺腫瘤,以免發(fā)生針道種植轉(zhuǎn)移。 注射完成后觀察1 h,如無(wú)異常,放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。 術(shù)后第4、8、12 天, 各組隨機(jī)選取6 只兔經(jīng)耳緣靜脈注射空氣15～20 mL 處死, 切取腫瘤浸泡于4%甲醛溶液。

1.5 瘤組織內(nèi)HIF-1α、VEGF 和MVD 檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤內(nèi)CD31 標(biāo)記的MVD 及HIF-1α、VEGF 表達(dá): 免疫組化染色完成后,將每張切片于高倍鏡（×200）視野下選取染色最為集中處拍照并將圖像輸入Image-Pro Plus 6.0 生物醫(yī)學(xué)影像分析系統(tǒng)進(jìn)行染色強(qiáng)度即累積吸光度（IOD）檢測(cè),記錄單位面積IOD 值；4%甲醛固定腫瘤標(biāo)本沖洗干凈,脫水、包埋、切片（厚3 μm）、烤片、脫蠟、水化,pH6.0 檸檬酸鹽緩沖液加入染色盒,放入緩沖液高溫高壓處理10 min,染色盒于室溫下自然冷卻,蒸餾水沖洗2 次后磷酸緩沖液（PBS）洗3 min×3 次,3%H2O2室溫孵育10 min,PBS 洗3 min×3 次, 加入100 μL 血清封閉液, 室溫孵育10 min,PBS 洗3 min×3 次,加入一抗（美國(guó)Novus 生物制品公司）,孵育過夜,PBS 洗3 min×3 次,加入一抗增強(qiáng)劑,室溫孵育30 min 后PBS 洗3 min×3 次,滴加即用型二抗,室溫避光孵育30 min,PBS 洗3 min×3 次,以二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色,蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,多組比較用方差分析,組間兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組不同時(shí)間點(diǎn)瘤組織內(nèi)HIF-1α 表達(dá)比較見表1、圖1。 術(shù)后第4、8 天B 組瘤組織內(nèi)HIF-1α 表達(dá)低于A 組,術(shù)后第12 天略高于A 組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后C、D 組瘤組織內(nèi)HIF-1α表達(dá)均高于A 組,C 組更明顯, 第12 天C 組與A、B、D 組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,余各組間于同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)瘤組織內(nèi)HIF-1α 表達(dá)比較 x±s

圖1 各組第12 天腫瘤內(nèi)HIF-1α 表達(dá)(目鏡×物鏡，10×20 倍)

各組不同時(shí)間點(diǎn)瘤組織內(nèi)VEGF 表達(dá)比較見表2、 圖2。 術(shù)后第4 天B 組、C 組瘤組織內(nèi)VEGF表達(dá)稍低于A 組,其余時(shí)間節(jié)點(diǎn)及D 組瘤內(nèi)VEGF表達(dá)均高于A 組, 且在第8 天C、D 組與A 組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,余同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

各組不同時(shí)間點(diǎn)瘤組織內(nèi)CD31 標(biāo)記的MVD比較見表3。 與A 組相比,術(shù)后第4、8 天B 組瘤組織內(nèi)MVD 形成減少,術(shù)后第12 天略增高,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 C 組瘤組織內(nèi)MVD 形成在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)均高于A、B、D 組, 但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）； 術(shù)后第4 天D 組瘤組織內(nèi)MVD 形成高于A 組, 第8 天和第12 天低于A 組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)瘤組織內(nèi)VEGF 表達(dá)比較 x±s

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)瘤組織內(nèi)CD31 標(biāo)記的MVD 比較x±s

圖2 各組第8 天腫瘤內(nèi)VEGF 表達(dá)(目鏡×物鏡，10×20 倍)

3 討論

缺氧是腫瘤組織的重要生物學(xué)特征之一。 腫瘤細(xì)胞快速分裂增殖導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)離血管,使得腫瘤細(xì)胞處于缺氧環(huán)境,長(zhǎng)期缺氧將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生HIF-1α［5］。 在正常氧飽和度情況下,HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)中被脯氨酸羥化酶滅活而處于失活狀態(tài),而在缺氧狀態(tài)、氧化應(yīng)激時(shí),脯氨酸羥化酶被抑制,HIF-1α 不能被滅活而與HIF-1β 結(jié)合形成異源型二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核, 異源型二聚體與DNA 分子上缺氧反應(yīng)元件結(jié)合, 從而調(diào)節(jié)某些基因,使VEGF、促紅細(xì)胞生成素、糖酵解酶表達(dá)增多。 VEGF表達(dá)增多可促進(jìn)血管形成,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和存活［6］,使腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加。 因此,改善腫瘤缺氧狀態(tài)有可能促進(jìn)HIF-1α 滅活,使VEGF 表達(dá)減少,腫瘤血管形成減少,從而改善腫瘤患者預(yù)后。

臭氧又稱為“活性氧”,由3 個(gè)氧原子構(gòu)成,在常溫常壓下是一種淡藍(lán)色、有魚腥臭味的刺激性氣體,1840 年由德國(guó)科學(xué)家Schonbein 發(fā)現(xiàn)［7］。 它具有強(qiáng)氧化性, 其氧化性僅次于氟和羥基, 對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌等病原微生物具有極強(qiáng)的殺滅作用,同時(shí)可改善局部血液循環(huán),增加局部氧供［8］。早期研究表明, 腫瘤缺血缺氧將會(huì)增加其對(duì)放化療的抵抗性,嚴(yán)重影響預(yù)后,因此減輕腫瘤缺氧對(duì)改善預(yù)后有重要作用［9-10］。 臭氧可改善腫瘤缺血缺氧狀態(tài),尤其是在腫瘤內(nèi)氧分壓低于5 mmHg 時(shí)效果最佳［2-3］,使到達(dá)腫瘤局部的化療藥物或放療增敏劑等增多,從而增強(qiáng)放化療效果；且實(shí)驗(yàn)研究亦表明單一臭氧療法或臭氧聯(lián)合放化療及光動(dòng)力療法可明顯降低腫瘤細(xì)胞活性或抑制腫瘤生長(zhǎng)［11-15］。

本研究結(jié)果顯示,連續(xù)多次注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液可能導(dǎo)致腫瘤內(nèi)HIF-1α、VEGF 表達(dá)增加,MVD 形成增多, 其原因可能為短時(shí)間內(nèi)連續(xù)多次臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內(nèi)注射加重腫瘤內(nèi)已有氧化應(yīng)激,從而抑制脯氨酸羥化酶活性,導(dǎo)致腫瘤內(nèi)HIF-1α 滅活減少,VEGF 表達(dá)增多, 促進(jìn)腫瘤微血管生成,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。 本實(shí)驗(yàn)療效部分研究也發(fā)現(xiàn),與單次臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內(nèi)注射組相比,多次注射對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制效果較差（另文發(fā)表）。 已有研究表明,臭氧濃度過高或劑量過大可能會(huì)加重原已存在的氧化應(yīng)激,而臭氧治療用途主要是通過適度的氧化應(yīng)激激發(fā)機(jī)體各種反應(yīng),如抗氧化還原反應(yīng)、免疫反應(yīng)等［16-17］。本研究結(jié)果還顯示單次臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內(nèi)注射,雖可使腫瘤組織內(nèi)HIF-1α、VEGF 表達(dá)及MVD 形成呈下降趨勢(shì),但并無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分析其原因可能為樣本量不足或所用臭氧濃度/劑量過低,或?yàn)橹委焺┝砍粞鯇?duì)腫瘤內(nèi)HIF-1α、VEGF 表達(dá)及MVD 形成無(wú)明顯影響。 然而Guclu 等［18］研究臭氧療法治療糖尿病性腎病對(duì)HIF-1α、 腫瘤壞死因子（TNF）-α 等表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)50 μg/mL 臭氧可使病變組織內(nèi)HIF-1α 表達(dá)下調(diào)。 Jin 等［19］研究臭氧對(duì)鼻咽癌放療患者血清HIF-1α、VEGF 水平的影響,發(fā)現(xiàn)10～20 μg/mL 臭氧（100 mL）可下調(diào)血清中HIF-1α、VEGF 水平。因此,下一步擬通過增加樣本量、改變臭氧濃度和劑量等方面研究臭氧對(duì)腫瘤內(nèi)HIF-1α、VEGF 水平及MVD 形成的影響,以期更加全面地評(píng)估其對(duì)改善腫瘤乏氧的可能性。

綜上所述,本研究認(rèn)為臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內(nèi)單次注射對(duì)腫瘤組織內(nèi)HIF-1α、VEGF 表達(dá)及MVD 形成無(wú)明顯影響, 但多次注射可能導(dǎo)致HIF-1α、VEGF 高表達(dá),MVD 形成呈增加趨勢(shì)。但確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。