紅松種子園單株ISSR-PCR遺傳多樣性分析

童茜坪 剡麗梅 張磊

摘要： ?以林口青山紅松無性系種子園216個單株生健康嫩葉為試驗材料，利用ISSR-PCR分子標記技術分析其遺傳多樣性的試驗結果表明：從100條引物中共篩選出11條具有多態(tài)性的ISSR引物，經ISSR-PCR擴增后共獲得102個位點，多態(tài)性譜帶102條，多態(tài)位點比率為100%，單株有效等位基因數(shù)變動范圍為1.004 6～2.000，群體總基因多樣性指數(shù)為0.333 3，Shannon多樣性指數(shù)為0.016 4～0.693 1，期望雜合度為0.004 6～0.500 0，紅松種子園單株具有豐富的遺傳多樣性。

關鍵詞： ?ISSR; ?紅松; ?單株; ?遺傳多樣性

中圖分類號： ? S 722. 8 + 3， ?S 791. 247 ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： ? A ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1001 - 9499（2020）02 - 0017 - 04

紅松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc）為松科松屬的喬木植物， 分布于中國東北長白山和小興安嶺，是我國東北地區(qū)的頂級森林植被建群樹種，也是優(yōu)良的用材和油料樹種。不同物種的遺傳物質是不同的，物種的遺傳多樣性越豐富，適應環(huán)境變化的能力就越強[ 1 - 8 ]，而物種遺傳多樣性研究一直是生物學研究的重點。ISSR分子標記技術具有簡單、快捷和成本低的特點，已廣泛的應用于遺傳多樣性分析、遺傳育種、種植資源鑒別等內容[ 9 - 17 ]。李雪峰通過利用ISSR和RAPD兩種標記方法對興安落葉松105個無性系個體進行遺傳多樣性分析，從分子水平上證明了興安落葉松種源具有豐富的遺傳多樣性[ 18 ]。馮富娟等對露水河天然種群和種子園內紅松優(yōu)良無性系的遺傳多樣性的研究[ 19 ]。邱新宇應用ISSR標記了青山種子園長白落葉松種子園單株樣本[ 20 ]。魏利以引種俄羅斯的西伯利亞紅松不同地理分布區(qū)的19個種群為材料，應用ISSR分子標記技術，進行西伯利亞紅松遺傳多樣性以及種群劃分，證明西伯利亞紅松種群具有豐富的遺傳多樣性[ 21 ]。當前，對紅松分子標記遺傳多樣性的研究仍然較少，東北林業(yè)大學利用已經開發(fā)的落葉松ISSR分子標記，優(yōu)化了紅松ISSR分子標記技術，這對其輔助育種及親緣關系和遺傳多樣性分析等研究均具有重要意義。本研究采用黑龍江省林口青山紅松無性系種子園的紅松單株，從DNA水平上分析遺傳多樣性，為紅松無性系分子鑒定與遺傳保護提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料為黑龍江省林口青山紅松種子園定植的216株紅松單株，1974年定砧木，1978年嫁接，接穗來源于五營林業(yè)局。2017年7月4日，采取當年生幼嫩健康嫩葉，將灰塵雜物擦凈，分別編號，置于冰盒保存，帶回試驗室后于冰箱-80 ℃冷凍保存。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA的提取與檢測

利用試劑盒提取紅松總DNA，定容不少于50 uL洗脫緩沖液（北京天根生化科技有限公司生產）。提取的DNA置于冰箱-40 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂秒娪緝x（DYY-2C，北京六一生物科技有限公司生產），用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳及紫外吸收法檢測DNA質量，電泳觀察DNA條帶清晰明亮，無明顯雜帶，則說明DNA完整性較好。樣品DNA最終濃度應大于50 ng/uL，以80～100 ng/uL為最宜，DNA在260 nm和280 nm波長下的吸光度比以OD260/OD280=1.7～1.9為宜。若樣品DNA OD260/OD280在2.0～2.3之間，則說明DNA中有RNA污染。

1. 2. 2 引物篩選

參照加拿大不列顛哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR引物序列（上海生工公司合成），隨機選取3個單株作為模板進行引物篩選，初篩出44條能擴增出條帶的引物，再進一步選取11條擴增條帶多且清晰的引物用于后續(xù)PCR擴增。

1. 2. 3 ISSR-PCR反應體系和擴增程序

擴增體系25 uL的PCR反應液：模板DNA 1 uL，Taq DNA 聚合酶（5U/uL） 1 uL，10×PCR Buffer 2.5 ul，DNTP 2 ul，引物（10 μmol/L） 1 uL，ddH2O 17.5 uL。擴增程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃（引物TM+5 ℃）退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)， 72 ℃補延伸7 min[ 23 ]。從多次試驗結果來看，該體系能有效擴增片段，減少PCR儀的損壞率。

1. 2. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與遺傳多樣性分析

利用ISSR反應產生的凝膠電泳圖譜，與2 000 bpMaker進行比對分析PCR擴增產物片段的大小，按擴增條帶的有無記為“1”和“0”，統(tǒng)計條帶數(shù)并建立0～1矩陣。利用Popgene32軟件計算紅松216個單株的多態(tài)性位點數(shù) （N， number of polymorphic loci）、多態(tài)性位點百分率（PPL， percentage of polymorphic loci）、有效等位基因數(shù)（Ne， effective number of alleles）、期望雜合度（He，Nei's gene diversity）、Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I ，Shannon's Information index） [ 24 - 26 ]。

2 結果與分析

2. 1 DNA質量檢測

由紅松基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖1）可以看出：DNA窄帶較亮且比較集中，未發(fā)現(xiàn)有拖帶彌散現(xiàn)象，提取的紅松DNA樣品濃度及純度符合后續(xù)試驗的要求。

2. 2 引物篩選

根據(jù)電泳結果，從100條引物中篩選出11條譜帶清晰、差異明顯、重復性和穩(wěn)定性高的引物，引物名稱及序列見表1。

2. 3 ISSR-PCR擴增

利用11個引物對紅松216個單株的DNA樣品進行ISSR-PCR擴增，共檢測到102個位點，位點范圍為250～3 000 bp，多態(tài)位點有102個，多態(tài)位點比率高達100%。多態(tài)位點比率反映了群體遺傳變異水平的高低，對環(huán)境適應能力強的群體多態(tài)位點比率也比較高[ 19 ]，試驗結果說明不同紅松單株對該地區(qū)的適應性極強，存在較高水平的變異。不同引物擴增的多態(tài)性條帶在4～15條之間，平均每個引物擴增9.27個條帶，其中，引物UBC841擴增位點最多，多達15個位點，多態(tài)位點百分率為60.49%，其它引物UBC864、UBC835、UBC823、UBC808多態(tài)位點百分率也在50%以上，這說明ISSR分子標記技術在檢測紅松基因組遺傳多態(tài)性上有較好的檢出效率。

2. 4 單株遺傳多樣性分析

由紅松ISSR單株多態(tài)性位點分析（表2）和紅松單株之間的遺傳相似性和遺傳距離（表3）可以看出：（1）單株等位基因數(shù)為2.000，有效等位基因數(shù)變動范圍為1.0046～2.000，其中，第57號單株有效等位基因數(shù)最小，第92號單株有效等位基因數(shù)最大。（2）Nei's指數(shù)（期望雜合度）為0.004 6～0.500 0，Shannon多樣性指數(shù)為0.016 4～0.693 1，群體總基因多樣性指數(shù)為0.333 3，總信息指數(shù)為0.495 4。表明群體中單株之間分化強烈，遺傳變異差別較大。（3）遺傳一致度變化范圍為0.352 9～0.951 0，遺傳距離范圍為0.050 3～1.041 5，變化幅度較大，說明216個紅松單株之間的親緣關系較遠。其中，第42和43單株遺傳一致度最大（0.995 10），遺傳距離最小（0.050 3），說明這兩個單株之間遺傳分化最小，親緣關系最近，極大可能性來源于同一個無性系。第99和31，32單株之間遺傳一致度最小（0.352 9），遺傳距離最大（1.041 5），表明第99號單株與31，32單株之間遺傳分化最大，親緣關系最遠。

3 結論與討論

對紅松種子園單株樣本進行ISSR顯性標記，得到多態(tài)性譜帶102條，多態(tài)位點比率高達100%，Nei's指數(shù)為0.004 6～0.500 0，Shannon多樣性指數(shù)為0.016 4～0.693 1，遺傳距離為0.050 3～1.041 5，這表明林口青山紅松種子園中各單株之間遺傳變異明顯，親緣關系變幅大，多態(tài)性高對環(huán)境適應強。對比邱新宇運用ISSR標記長白落葉松種子園單株樣本結果[ 20 ]，林口青山紅松種子園單株多態(tài)性更高對環(huán)境的適應能力更強，遺傳多樣性更高，群體總體遺傳變異水平更高，單株間分化強烈，遺傳變異變化幅度更廣，可提供大量無親緣關系的優(yōu)良紅松種子。由此可以認定，林口青山種子園的紅松單株無性系有較高的遺傳多樣性水平，且并未在人工栽培馴化過程中丟失大量遺傳變異，更容易擴展其分布范圍，擁有較高的進化潛力，可用于大量培育優(yōu)質紅松單株。

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第1作者簡介： ?童茜坪（1998- ）， ?女， ?本科， ?研究方向： ?林木遺傳育種。

通訊作者： ?張含國（1962- ）， ?男， ?教授， ?博導， ?研究方向： ?林木遺傳育種。

收稿日期： 2020 - 01 - 20

（責任編輯： ? 王 巖）

Abstract With healthy young needles from 216 single plant of Pinus koraiensis in the seed orchard of Linkou， we studied the genetic diversity by ISSR markers. The results showed that 11 polymorphic ISSR primers were screened from 100 primers. After ISSR-PCR were amplified， a total of 102 loci were obtained， and there are 102 polymorphic loci， whose average polymorphism percentage was 100%. The variation range of effective alleles per plant was 1.004 6～2.000. The total genetic diversity index of population was 0.333 3. The Shannon diversity index was 0.016 4～0.693 1， and Nei's gene diversity index was 0.004 6～0.500 0. Finally， Pinus koraiensis in seed orchard had abundant genetic diversity.

Key words ISSR; ?Pinus koraiensis; ?Individual; ?Genetic diversity