腺苷預處理對缺血性腦卒中大鼠血腦屏障通透性及AQP4表達的影響

許二妮， 龐艷利， 譚 軍

腦卒中的發生率很高，缺血性腦卒中的比例很大。腦缺血后恢復血液供應可能導致更嚴重的腦功能障礙，這種現象稱為缺血再灌注(ischemia reperfusion IR)。腦水腫是腦缺血再灌注損傷的常見后遺癥。腦水腫的機制尚未完全闡明，可能與腦微循環，血腦屏障疾病和水通道蛋白等因素有關。血腦屏障通常起屏障作用，并維持中樞神經系統的內部環境。血腦屏障的結構完整性和功能取決于內皮細胞和星形膠質細胞表面水通道蛋白4( aquaporin-4，AQP4) 的表達及其活性形式OAPs( orthogonal arrays of particles) 的形成[1，2]。越來越多的研究發現AQP4的表達與血腦屏障通透性呈正相關。缺血性損傷后一系列病理生理變化破壞了血腦屏障的完整性，導致其通透性增加，致腦水腫形成。血腦屏障結構的完整性與腦水腫的形成密切相關，因此解決受損的血腦屏障問題已成為預防缺血再灌注損傷的關鍵[3]。使用神經保護劑改善腦缺血再灌注損傷受到越來越多的關注[4]。大量的實驗研究表明，腺苷具有大腦保護作用。腺苷對缺血再灌注損傷的血腦屏障功能影響的先前研究尚未在文獻中報道。因此，本實驗探討了腺苷預處理對缺血性卒中大鼠血腦屏障通透性和AQP4表達的影響，從血腦屏障的角度來探討腺苷對腦缺血再灌注損傷的影響及其可能的腦保護機制，并為腺苷用于預防或減輕缺血性腦卒中后腦水腫的發病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠180只(250±30 g)，在通風良好的動物籠中飼養。大鼠隨機分為假手術組(F組)、模型組(IR組)、腺苷預處理組(AP組)，每組60只。每組按術后執行時間分為4個亞組：6 h、24 h、48 h和 72 h (F6、24、48、72 h、ir6、24、48、72 h、AP6、24、48、72 h)。腺苷注射液1.5 mg/kg(生理鹽水稀釋至2 ml)于造模前3 d腹腔注射于AP組，每日1次，連續3 d；F、IR組于術前3 d腹腔注射生理鹽水2 ml，每日1次，共3次。

1.2 主要儀器、藥品與試劑 MACO線栓(北京西濃科技有限公司)；腺苷注射液(沈陽光大制藥有限公司)；Evans Blue粉末(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗大鼠AQP4多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法 AP組和IR組制作大腦中動脈閉塞( MCAO)模型。實驗所需用具均75%酒精消毒。術前腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100g)麻醉，麻醉后固定在大鼠解剖專用手術臺上，行頸正中切口，暴露右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)，向近端分離出頸內動脈(internal carotid artery，ICA)及頸外動脈(external carotid artery，ECA)。無菌縫線結扎CCA和ECA后，動脈夾夾閉ICA，在ICA和ECA交叉口下方1.0 cm處用眼科剪在CCA上剪一斜小口，將MCAO線栓插入斜小口進入ICA，結扎CCA，松開動脈夾，連續插入MCAO線栓，使線栓上標記的黑點進入動脈交叉處，即插入深度約為18～20 mm，說明線栓到達大腦中動脈，固定并結扎線栓，然后縫合皮膚、消毒。栓塞2 h后，拔出約1 cm線栓，恢復大腦中動脈和Willis環的血供。F組僅切取頸部皮膚，分離ICA、ECA、CCA，不結扎暴露，逐層縫合消毒。本實驗對大鼠生命體征進行嚴密觀察，術后單獨籠飼養。

1.4 腦水含量的測定 每個亞組隨機取5只大鼠斷頭取腦，應用干、濕重法，將腦組織放在電子天平上，秤濕重，置入烤箱中(105 ℃，24 h)，秤干重。腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 EB滲透法定量分析血腦屏障通透性變化 缺血后2 h，再灌注各時間點前1 h，股靜脈注射2%伊文思藍溶液，劑量4 ml/kg，通過血液循環可以看到老鼠的口鼻、四肢變藍；循環2 h后，0.9%氯化鈉溶液200 ml以50 ml/min的速度經左心房灌注，可見透明液體從左耳廓流出，斷頭取腦稱重；稱取腦組織，置于甲酰胺溶液(1 ml/100 mg)中，勻漿，60℃恒溫水浴中孵育24 h，離心(時間：20 min；轉速：4000 r/min)，提取上清液，用分光光度計測630 nm處吸光值(OD值)，同時測定已知不同梯度的標準EB的OD值，繪制標準曲線。根據標準曲線計算出待測樣品的EB含量。

1.6 AQP4免疫組化檢測 烤片，脫蠟，水化，3%H2O2，室溫孵育10 min，浸入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，加熱至100 ℃抗原修復5 min，加入一抗(兔抗大鼠AQP4多克隆抗體，稀釋1∶100)，4 ℃過夜，加入生物素標記二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色，蒸餾水終止反應，封片。最后光學顯微鏡觀察，采用HPIAS-2000病理圖文分析系統，對每張切片大腦陽性細胞的著色強度進行平均光密度測量，就AQP4的表達分析其平均光密度值(mean optical density，MOD)。

2 結 果

2.1 各組大鼠不同時間點腦組織含水量 IR組和AP組與F組比較腦水含量均明顯增多，差異具有統計學意義(P<0.05)；AP組與IR組比較，腦水含量顯著減少，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 各組大鼠不同時間點腦內EB滲出變化 IR組和AP組EB滲出量與F組比較均明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；IR組和AP組組內比較，6 h～48 h腦組織EB滲出量呈逐漸上升趨勢，48 h達到高峰后開始下降但仍高于正常水平；AP組EB滲出量均低于IR組對應時間點的EB滲出量，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.3 各組大鼠不同時間點AQP4表達變化 光鏡下，AQP4陽性產物主要分布于梗死周圍水腫區、梗死側皮質及血管、星形膠質細胞等。AQP4陽性為膜蛋白棕黃色或褐色的深染。AQP4蛋白在F組表達較弱，僅有少量陽性細胞；在IR組和AP組AQP4蛋白表達明顯高于F組，AQP4蛋白表達在缺氧缺血后隨時間延遲表達逐漸增多；與IR組比較，AP組AQP4蛋白表達逐漸下降(見圖1)。

2.4 大鼠腦缺血再灌注損傷后EB滲出量與AQP4之間的相關性分析 經SPSS22.0軟件檢驗，腦缺血再灌注損傷造模組(IR組和AP組)各時間點EB含量和AQP4均符合正態分布，用Pearson進行相關性分析。腦缺血再灌注損傷后AQP4的表達與EB含量(r=0.898)呈正相關，差異具有統計學意義(P<0.05)。腦缺血再灌注損傷后AQP4表達越高，血腦屏障通透性越高(見圖2)。

表1 各組大鼠不同時間點腦組織含水量的比較

表2 各組大鼠不同時間點腦內EB滲出量的比較

表3 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時間點AQP4表達變化平均光密度值)

F組×400倍 IR-6 h組×400倍 IR-24 h組×400倍

IR-48 h組×400倍 IR-72 h組×400倍 AP-6 h組×400倍

AP-24 h組×400倍 AP-48 h組×400倍 AP-72 h組×400倍

圖2 AQP4表達與EB滲出量的相關性

由圖1和表3可見：IR組和AP組AQP4表達與F組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；IR組和AP組組內比較，6 h～48 h AQP4表達逐漸升高，于48 h達高峰，再灌注72 h時仍處于高峰；AP組AQP4表達明顯低于IR組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

缺血性卒中的治療是盡快恢復腦血流灌注，但是腦血流灌注恢復后不可避免地會導致腦缺血再灌注損傷，這是一個非常復雜的病理生理過程。預防比治療更重要，并且現在越來越關注預處理方法。腦缺血預處理的更多選擇是藥物預處理。研究發現，當將許多外源性藥物用于腦缺血再灌注時，可通過不同途徑刺激內源性腺苷的分泌，從而保護腦組織[5]。考慮到外源性腺苷也可用于治療缺血再灌注腦損傷，本實驗使用外源性腺苷探索其在缺血性卒中中的作用及其可能的相關機制。譚軍等[6～8]該研究小組的論文在研究中得出了某些結論，為實驗成功提供了基礎。

血腦屏障是指腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障。血液中多種溶質從腦毛細血管進入腦組織，有難有易，有些很快，有些較慢通過，有些則完全不能通過，這種有選擇性的通透現象稱為血腦屏障通透性。在生理條件下，血腦屏障嚴格控制電解質等水溶性物質進入腦組織，主要起屏障作用。腦水腫是腦缺血再灌注損傷的主要并發癥之一。血管源性腦水腫主要是由于血腦屏障完整性受到破壞，導致血腦屏障通透性增加引起血漿蛋白、水分和電解質等大分子物質向外滲出所致的細胞間質水腫。血腦屏障是血液與腦組織之間的屏障，在生理條件下，血腦屏障嚴格控制電解質等水溶性物質進入腦組織，主要起屏障作用。腦缺血再灌注后的一系列病理生理變化損害了血腦屏障的完整性，增加了血腦屏障的通透性，促進了腦水腫的形成[9，10]。實驗測定腦組織含水量即可以反應血腦屏障通透性的變化。本實驗發現腺苷預處理后腦組織含水量較模型組明顯減少。這表明腺苷預處理可減輕腦水含量從而達到保護腦組織的作用。正常情況下血漿白蛋白無法透過血腦屏障，EB是一種常用的偶氮染料制劑，與血漿蛋白高度親和，因此EB在神經科學研究中常被用于示蹤劑觀察血腦屏障的完整性[11]。染色時，如果血腦屏障是完整的，血漿白蛋白無法透過血腦屏障，與血漿白蛋白結合的EB無法使其著色；相反如果血腦屏障被破壞，血漿白蛋白透過血腦屏障，與EB結合使其著色。本實驗中，選用EB作為血腦屏障的示蹤劑，它可以與血清蛋白結合形成伊文思藍結合蛋白，僅當打開血腦屏障時伊文思藍結合蛋白才能隨血管內的蛋白成分進入組織間隙，滲出到腦組織中的EB的量與血腦屏障破壞的程度呈正相關[12]。運用其來測定缺血再灌注損傷后不同時間點的血腦屏障通透性。結果顯示，缺血再灌注6 h，模型組和腺苷預處理組的EB滲出量與對照組相比有統計學差異，表明血漿蛋白滲出，血腦屏障已打開，通透性增加，并且呈上升趨勢。它在48 h達到峰值，在72 h下降，但仍高于正常水平。這表明血腦屏障通透性與再灌注時間密切相關。這與王社軍等[13]的發現是一致的，其通過測量腦組織中14C蔗糖的方法對大鼠大腦中動脈缺血再灌注后通透性的研究。與模型組相比，腺苷預處理組的EB滲出量明顯減少，且差異具有統計學意義，表明腺苷可以抑制缺血再灌注后血腦屏障通透性的增加，從而減輕血管源性腦水腫，減輕腦損傷。

據報道，腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成與水通道(aquaporin，AQP)密切相關[14]。其中，AQP4是中樞神經系統的主要水通道，廣泛分布于腦組織，與腦水腫形成的生理病理過程密切相關。AQP4在腦毛細血管星形膠質細胞足突和腦室室周上皮細胞中表達，通過調節細胞外空間維持腦細胞的滲透穩態，維持大腦的興奮性，具有重要的生理功能[15]。有研究指出[16]，AQP4的表達水平變化與腦水腫的發生發展及消退基本一致。傳統觀點認為，兩側靜水壓和滲透壓的不平衡是導致血腦屏障滲透率增加的主要原因。隨著分子生物學和蛋白質組學的發展，研究人員發現AQP4也參與調控血腦屏障的發育成熟，其表達水平與血腦屏障的完整性密切相關[17～19]。

本實驗結果顯示，腦缺血再灌注后6 h～48 h模型組及腺苷預處理組AQP4表達呈逐漸上升趨勢，48 h達高峰，72 h仍處于較高水平。此過程與腦組織EB滲出量變化趨勢一致。這符合Mardey[20]的研究模型即腦水腫所致急性水中毒，AQP4低表達在正常腦組織和高表達在腦水腫，表明AQP4與腦水腫密切相關。與Taniguchi等[21]對大腦中動脈閉塞后腦水腫的研究結果相似，AQP4 mRNA表達上調與腦組織含水量的結果平行。說明AQP4是膠質細胞、血液和腦脊液之間水調節和運輸水分的重要通道，其表達水平與血腦屏障的完整性密切相關。也證實AQP4的表達與缺血再灌注后血腦屏障通透性損傷密切相關。由此可見，AQP4與腦水腫的形成密切相關，同時提示AQP4可能通過影響血腦屏障而參與水腫的形成。結果還顯示腺苷預處理組AQP4表達低于模型組，說明腺苷具有神經保護作用，可能是通過某種通路途徑抑制AQP4的表達，減輕血腦屏障的損傷，從而減輕腦水腫，達到治療缺血性腦血管病的目的。

綜上所述，腺苷預處理可能通過下調AQP4表達，改善血腦屏障通透性，減輕腦水腫，起到腦保護的作用，為腺苷預處理用于缺血性腦卒中的臨床治療提供了理論依據，但對于腺苷預處理下調AQP4表達的具體機制尚不清楚，其有待進一步研究。