頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究

鄒 璇， 王 辰， 劉一靜， 施銘崗， 安中平， 黃慧玲， 周官恩

頸動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素之一。動(dòng)脈粥樣硬化研究表明，不穩(wěn)定斑塊即使不引起嚴(yán)重的動(dòng)脈狹窄，也會(huì)造成不同程度的缺血性腦卒中。與動(dòng)脈狹窄比較，斑塊本身成分及穩(wěn)定性與缺血性腦血管事件密切相關(guān)，因此，不穩(wěn)定性斑塊檢測(cè)、影響因素及治療方法的選擇具有重要意義[1]。由于受手術(shù)標(biāo)本的限制，有關(guān)頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚少。本研究試圖建立頸動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊的表達(dá)圖譜，進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出差異表達(dá)蛋白，尋找對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊診斷有特異性和敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①臨床診斷明確的新發(fā)急性缺血性卒中患者；②年齡>18歲(本組均為>60歲的患者)，漢族；③發(fā)病距就診日期在7 d內(nèi)；④完成顱腦磁共振彌散加權(quán)成像成像(diffusion weighted imaging，DWI)檢查；⑤實(shí)驗(yàn)方案通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全部研究對(duì)象均簽署書面知情同意書。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 存在腦供血?jiǎng)用}粥樣硬化的患者出現(xiàn)心源性腦栓塞；存在嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙的患者；風(fēng)濕性疾病、慢性炎癥性疾病以及結(jié)核、惡性腫瘤、妊娠者。患者或家屬不同意參加此項(xiàng)研究。

1.1.3 分組 依據(jù)頸動(dòng)脈B超檢查結(jié)果分為頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊組、頸動(dòng)脈穩(wěn)定斑塊組。頸部血管超聲檢查發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈狹窄，且做頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)的缺血性卒中患者20例。收集所有入組患者的臨床資料，具體包括性別、年齡、既往疾病、吸煙史、飲酒史、白蛋白、總蛋白、空腹血糖、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、尿酸。

1.2 頸內(nèi)動(dòng)脈多普勒超聲檢查 頸動(dòng)脈超聲檢查由超聲診斷科從事血管超聲的兩名高年資醫(yī)師獨(dú)立操作。取其結(jié)果一致的病例入組。將所有大動(dòng)脈型粥樣硬化型腦梗死患者于入院2 d內(nèi)完善頸動(dòng)脈多普勒超聲檢查，當(dāng)一側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度≥1.2 mm時(shí)提示斑塊形成，將斑塊分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊。穩(wěn)定斑塊(硬斑塊)為超聲提示斑塊強(qiáng)回聲伴聲影、表面光滑、質(zhì)地均勻；不穩(wěn)定斑塊(軟斑塊)為超聲提示低回聲或回聲強(qiáng)弱不均、表面高低不平、質(zhì)地不均勻等。混合型斑塊(既有穩(wěn)定斑塊又有不穩(wěn)定斑塊)歸類為不穩(wěn)定斑塊組[2，3]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣本蛋白的提取 取樣品加入適量lysisbuffer(7 M尿素，2 M硫脲，0.1% CHAPS)，渦旋混勻，(裂解液：蛋白酶抑制劑50：1加入蛋白酶抑制劑)組織破碎儀70 Hz，60 s，重復(fù)3次。細(xì)胞樣本加入適量lysisbuffer(7 M尿素，2 M硫脲，0.1%CHAPS)，渦旋混勻，超聲1 s，停1 s，累計(jì)20 s。14000 r/min，離心30 min，取上清，分裝，留取5 μl定量，其余凍入-80 ℃。

1.4.2 蛋白定量 采用Bradford法測(cè)定提取的蛋白濃度。先將樣本用lysis buffer進(jìn)行一定倍數(shù)稀釋使其終濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，稀釋好的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品(將BSA用lysis buffer溶解成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白)各取10 μl分別和300 μl蛋白定量染料避光反應(yīng)20 min，用酶標(biāo)儀同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在595 nm下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品每管吸光值和濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算樣本濃度。

1.4.3 利用SDS-PAGE酶解 用手術(shù)刀將每塊膠切成1 mm3小塊兒，置于1.5 ml Eppendorf 管中；用200 μl雙蒸水洗2次，每次10 min；加考染脫色液[50 mmol/L NH4HCO3與ACN(1：1)]或銀染脫色液200 μl {K3[Fe(CN)6] 與Na2S2O3(1：1)}，脫色15 min，雙蒸水洗，重復(fù)3次，直至脫色完全；加 ACN 100 μl 脫水至膠粒變白，真空抽干10 min；加10 mmol/L DTT(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，37 ℃水浴1 h，加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白；加 55 mmol/L IAA(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，置于暗室30 min，加ACN 100 μl脫水至膠粒變白；依次用下列溶液進(jìn)行混懸清洗：雙蒸水(1次)、ACN(1次)、雙蒸水(1次)、 ACN(1次)每次10 min；將0.01 μg/μl胰蛋白酶工作液(酶液用25 mmol/L NH4HCO3稀釋)，每管加100 μl，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4 ℃放置30 min。待酶液被膠粒完全吸收，再加25 mmol/L NH4HCO3100 μl，37 ℃過夜；次日離心收集酶解上清液，置于另一Eppendorf管中；剩余膠粒用抽提緩沖液(5%TFA、95% ddH2O)1 h，收集酶解上清液，置上一Eppendorf管中合并；剩余膠粒再用抽提緩沖液(2.5%TFA、50%ACN、47.5% ddH2O)1 h，收集酶解 上清液，置于上一Eppendorf管中合并；真空凍干，-20 ℃保存。

1.4.4 反相色譜OrbitrapFusion 進(jìn)行蛋白質(zhì)分析 將凍干樣本用60 μl 2%甲醇，0.1%甲酸復(fù)溶。12，000 r/min 離心10 min，吸取上清上樣。每次上樣體積10 μl，采取夾心法上樣，重復(fù)3次。LoadingPump流速300 nl/min，15 min。分離流速600 nl/min。

1.4.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

1.4.5.1 數(shù)據(jù)庫 數(shù)據(jù)庫的選擇是以所需物種、數(shù)據(jù)庫注釋完備性及序列可靠性為參考依據(jù)的。在選擇數(shù)據(jù)庫時(shí)，遵循如下原則，若為已經(jīng)測(cè)序生物，直接選用該物種數(shù)據(jù)庫，若為非測(cè)序生物，則選擇與被測(cè)樣品最為相關(guān)的大類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。本次使用數(shù)據(jù)庫：Uniprot-HUMAN(20190420 Download)數(shù)據(jù)庫。

1.4.5.2 檢索軟件 Label-free的質(zhì)譜分析是由Orbitrap Fusion型質(zhì)譜完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件 采用產(chǎn)MaxQuant軟件處理。

b) 閥門開啟瞬間保護(hù)軟閥芯密封面。閥門開啟瞬間閥芯頭部和閥座之間的間隙小于軟閥芯和閥座之間的間隙，使得閥芯延長(zhǎng)段和閥座之間的介質(zhì)流速遠(yuǎn)大于軟閥芯和閥座之間的介質(zhì)流速，實(shí)現(xiàn)了保護(hù)閥門軟密封面的作用。

2 結(jié) 果

2.1 不穩(wěn)定斑塊組與穩(wěn)定斑塊組間臨床資料比較 10例不穩(wěn)定斑塊組男性6例，女性4 例；年齡(66.5±5.5)歲。10例穩(wěn)定斑塊組男性5例，女性5 例；年齡(64.3±4.2)歲。單因素分析顯示，不穩(wěn)定斑塊組與穩(wěn)定斑塊組間在性別、年齡、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、高密度脂蛋白、白蛋白、總蛋白、尿酸等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 鑒定結(jié)果的總體分析和差異蛋白篩選

2.2.1 全局分析 直接提取Maxquant搜索后的結(jié)果中各樣品的定量值，去除有0 的結(jié)果后，得到Global目錄下的proteinGroups. normalize. rm0.heatmap. txt文件，聚類分析的結(jié)果顯示不穩(wěn)定斑塊組與穩(wěn)定斑塊組之間蛋白表達(dá)存在明顯差異(見圖1)。

2.2.2 差異蛋白篩選 定量值在進(jìn)行中值歸一化后得到proteinGroups. normalize. keep. txt 文件的結(jié)果，進(jìn)一步用perseuse歸一化后，得到proteinGroups. normalize. keep. imputation. txt的結(jié)果。由于樣品的重復(fù)次數(shù)大于等于3 次，因此直接采用t-test 進(jìn)行差異分析，卡p value 0.05，F(xiàn)old change 1.2倍，得到差異蛋白的分析結(jié)果。定出差異表達(dá)蛋白1240個(gè)，在不穩(wěn)定斑塊中，表達(dá)下調(diào)的蛋白有432個(gè)，表達(dá)上調(diào)的有808個(gè)(見圖2)。

2.2.3 COG分析 COG(Clusters of Orthologous Groups)分析是基于COG 數(shù)據(jù)庫是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行同源分類的而建立的，COG 建立了一個(gè)識(shí)別直系同源基因(指不同物種之間同源的基因，是因?yàn)槲锓N分化而逐漸產(chǎn)生差異的)的數(shù)據(jù)庫，通過對(duì)多種生物的蛋白質(zhì)序列大量比較而來的。COG 分析顯示差異表達(dá)蛋白涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯后修飾、、細(xì)胞骨架、蛋白酶解等方面(見圖3)。

2.2.4 GO分析 基因本體(Gene Ontology，GO)是描述基因的功能、定位和活動(dòng)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)詞匯表，具有樹形結(jié)構(gòu)，是分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣的本體，已經(jīng)成為生物信息領(lǐng)域中一個(gè)極為重要的方法和工具(見圖4)。

圖1 全局分析聚類熱圖

圖2 差異蛋白火山圖

圖3 COG 功能分類統(tǒng)計(jì)圖

圖4 細(xì)胞組分富集度分析

3 討 論

蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Willian于 1994年提出，指由一個(gè)基因組genome或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有 protein，也可以說是指細(xì)胞或組織或機(jī)體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式[3]。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式。蛋白質(zhì)組技術(shù)的出現(xiàn)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)巨大進(jìn)步。蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是后基因組研究中的最主要部分。蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門系統(tǒng)的高通量差異蛋白篩查技術(shù)，在疾病的發(fā)病機(jī)制、標(biāo)志物篩選中發(fā)揮著越來越重要的作用。非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)近年來成為重要的質(zhì)譜定量方法[3，4]，按照其原理分，主要有兩種。其中spectrum counts類的非標(biāo)記定量方法，發(fā)展比較早，也形成了多種算法進(jìn)行定量，但是主要的原理都是根據(jù)MS2的鑒定結(jié)果作為定量的基礎(chǔ)，各種方法的差別在于后期算法在大規(guī)模數(shù)據(jù)上的修正。第二種非標(biāo)記定量方法的原理是以MS1為基礎(chǔ)，計(jì)算每個(gè)肽段信號(hào)在LCMS 質(zhì)譜上的積分，這個(gè)也是本研究所采用的Maxquant 算法的原理。Label free(LFQ)算法，簡(jiǎn)單的來說，首先是對(duì)每個(gè)LCMS數(shù)據(jù)中的肽段信號(hào)進(jìn)行識(shí)別并定量，然后使用內(nèi)置的Andromeda算法對(duì)所有肽段信號(hào)的MS2進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，完成定性工作，最后整合所有的定性定量數(shù)據(jù)，完成整個(gè)定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)工作[5]。

Donners等選擇動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定型和伴血栓斑塊型，應(yīng)用二維凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)果顯示αl-抗胰蛋白酶在伴血栓斑塊表達(dá)，研究者認(rèn)為αl-抗胰蛋白酶在伴血栓斑塊病變中表達(dá)上調(diào)是一種防御機(jī)制，能夠抑制膠原蛋白酶和彈性蛋白酶活性，可能提高斑塊的纖維化[6]。Part 等利用2DE 對(duì)頸動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊核心區(qū)和周圍正常區(qū)組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。鑒定出21 種差異蛋白，其中hsp27 被驗(yàn)證并認(rèn)為是潛在的動(dòng)脈粥樣硬化生物標(biāo)記物[7]。Bagnato等利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究35個(gè)冠狀動(dòng)脈斑塊樣本。樣本有石蠟、冰凍組織和多聚甲醛固定標(biāo)本。從石蠟包埋組織可以鑒定225 種蛋白，從冰凍組織中卻可以鑒定出558 種蛋白。而且他們對(duì)冠狀動(dòng)脈血管壁層進(jìn)行了激光分割，通過LC-MS/MS 分析，共鑒定出806 種蛋白。并確認(rèn)了4 種在動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用重要蛋白，包括：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF β)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血小板衍生因子β(PDGF β)和基質(zhì)細(xì)胞源性因子1α(SDF 1α)[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用Lable Free非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)差異比較，鑒定出差異表達(dá)蛋白1240個(gè)，在不穩(wěn)定斑塊中，表達(dá)下調(diào)的蛋白有432個(gè)，表達(dá)上調(diào)的有808個(gè)。并運(yùn)用COG 分析顯示差異表達(dá)蛋白涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯后修飾、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架、蛋白酶解等方面。通過比較Fold change 值，得出Fold change值大的差異蛋白為溶酶體膜蛋白2，酰基丙酮酸酶FAHD1，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的乙酰轉(zhuǎn)移酶組分，三激酶/FMN環(huán)化酶，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1，復(fù)制蛋白A 70 kDa DNA結(jié)合亞單位，HLAⅠ類組織相容性抗原B-81α鏈，蛋白質(zhì)精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶1，二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白3，熱休克蛋白75。

頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成是一種涉及多種蛋白、細(xì)胞和組織異常的復(fù)雜疾病病理過程。雖然近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行了廣泛的多學(xué)科蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但還有許多問題需要做更深入的探討，如組織分離技術(shù)還是不夠精細(xì)；鑒定出動(dòng)脈粥樣硬化差異蛋白敏感性和特異性不高；一些作用不明的蛋白在不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊之間存在明顯差異[9]。本研究標(biāo)本量較少，對(duì)差異蛋白未在斑塊組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)驗(yàn)證觀察，需要進(jìn)一步研究。