亞麻木酚素通過抑制TXNIP和激活NLRP3炎癥小體減輕慢性間歇性低氧小鼠腎臟炎癥損傷*

劉 寒， 郭亞凈， 趙亞碩， 任 靜， 周 健， 吉恩生

（河北中醫(yī)學(xué)院科研中心，河北石家莊050200）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，以慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）為主要特征，患病率較高，在肥胖人群中高達70%，且臨床數(shù)據(jù)顯示不同年齡階段男性的患病率均高于女性［1］。其主要表現(xiàn)為睡眠期間反復(fù)發(fā)生上呼吸道的部分或完全阻塞，導(dǎo)致睡眠片段化、低氧血癥和高碳酸血癥［2］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，過去20年間未經(jīng)治療的OSA患者患晚期腎臟疾病的風(fēng)險顯著增加［2-3］。更有臨床數(shù)據(jù)證實，患有慢性腎病的患者多伴發(fā)失眠和呼吸障礙性疾?。?］。并且有學(xué)者提出長期的CIH會造成機體氧化應(yīng)激、慢性炎癥和代謝紊亂。

硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）［5］是機體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要成員，在各種病原刺激下（如LPS、病毒、氧化應(yīng)激等）與硫氧還蛋白1（thioredoxin-1，TRX-1）解離，并與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）結(jié)合從而激活NLRP3炎癥小體，促進炎癥因子白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的釋放，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。

近年來，亞麻籽因含有的某些生物活性成分如可溶性膳食纖維、木酚素和α-亞麻酸所帶來的健康效益而受到廣泛的關(guān)注。亞麻籽中含量最高且最主要的是亞麻木酚素（flax lignan）［6］，又稱為開環(huán)異落葉松脂素二葡萄糖苷（secoisolariciresinol diglucoside，SDG），是良好的天然抗氧化劑，具有多方面的藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松和糖尿病等。本研究以SDG的抗氧化、抗炎作用為出發(fā)點探討其是否可以減輕CIH引起的腎臟炎癥損傷及其潛在的機制研究。

材料和方法

1 動物

SPF級C57BL/6N小鼠30只，雄性，6～8周齡，18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0006。動物飼料和墊料購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程股份有限公司。

2 主要儀器與試劑

2.1 主要儀器 動物CIH裝置（Oxycycler Model 84）購自BioSpherix；多功能成像系統(tǒng)Fusion FX5 Spectra購自VIBER LOURMAT；多功能微孔板讀數(shù)儀Varioskan LUX購自Thermo Fisher；顯微拍照系統(tǒng)購自Leica；全自動生化分析儀Chemray 240購自深圳雷杜生命科技有限公司。

2.2 主要藥品與試劑 SDG購自愛必信生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（批號A001-1-2）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號A003-1-2）購自南京建成生物工程研究所；抗NLRP3抗體、抗含CARD的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗體、抗caspase-1抗體、抗IL-1β和抗IL-18抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；抗TXNIP抗體購自Proteintech；RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）購自北京索萊寶科技有限公司；Tween-20和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自Invitrogen。

3 主要方法

3.1 動物模型的建立及分組 將C57BL/6N小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為3組：正常（control）組、模型（CIH）組和治療（SDG）組，每組10只。SDG在臨用前用生理鹽水配成混懸液，連續(xù)給藥35 d（30 mg/kg，根據(jù)藥理實驗方法學(xué)，通過臨床人用藥量折算小鼠用藥量），另外2組給予等量生理鹽水。分別在小鼠上艙0.5 h前以灌胃方式給予。將模型組和治療組放置于間歇性低氧艙內(nèi)，每天持續(xù)時間8 h（8：00～16：00），共持續(xù)35 d，低氧艙程序設(shè)計為每一低氧復(fù)氧循環(huán)時間為3 min，前1.5 min充入100%N2使氧氣濃度降至9%，后1.5 min充入O2使氧氣濃度恢復(fù)到21%，如此循環(huán)，模擬中重度OSA。

3.2 標(biāo)本的采集 動物模型建立完成，各組小鼠禁食不禁水12h后，稱重。用1%的戊巴比妥鈉麻醉，眼球摘除取血，分離血清，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩４蜷_腹腔，迅速摘取腎臟，在冰板上去除腎表面的被膜并稱重。左腎放入4%多聚甲醛溶液中，以備后續(xù)的石蠟切片，剩余組織保存于-80℃冰箱。

3.3 腎功能指標(biāo)的檢測 應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量。

3.4 組織標(biāo)本的處理和指標(biāo)的檢測 將在4%多聚甲醛中固定的腎臟組織經(jīng)梯度乙醇脫水后進行石蠟包埋，切片機進行切片，厚度為5μm，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察腎小球和腎小管形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)染色檢測腎臟組織中NLRP3和TXNIP的蛋白表達情況，利用Image-Pro Plus 6.0對圖像進行吸光度分析。

3.5 相關(guān)炎癥因子和抗氧化指標(biāo)的檢測 ELISA法測定小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，具體步驟按試劑盒說明書操作，終止后使用酶標(biāo)儀450nm波長上讀出各孔吸光度（A）值，并根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組小鼠血清中炎癥因子的含量。羥胺法和硫代巴比妥酸法檢測腎組織SOD的活性和MDA的含量，具體步驟根據(jù)南京建成MDA測試盒和SOD測試盒說明書進行，分析腎臟組織氧化程度。

3.6 Western blot檢測腎臟組織中相關(guān)蛋白的表達 稱取小鼠腎臟組織30 mg左右，每10 mg組織加入已預(yù)冷的RIPA裂解液100μL，置于冰上15 min，隨后用組織破碎儀進行破碎，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，用BCA法測定蛋白濃度，最后通過Western blot檢測腎臟組織中TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey's法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CIH對小鼠腎臟指數(shù)的影響

與正常組相比，模型組小鼠體重和腎臟指數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與模型組相比，SDG治療組（以下簡稱治療組）的小鼠體重和腎臟指數(shù)的差異也無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），由此說明，CIH對小鼠體重?zé)o影響，見表1。

2 CIH對小鼠腎功能的影響

與正常組相比，模型組小鼠SCr水平有顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且經(jīng)過治療后，有所好轉(zhuǎn)；BUN水平變化不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠腎重、體重、腎臟指數(shù)、血尿素氮和血清肌酐的比較Table 1.The comparison of renal weight，body weight，ratio of renal weight to body weight（n=6），and blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（SCr）of the mice（n=4）in each group（Mean±SD）

3 SDG減輕CIH小鼠的腎臟病理損傷

3.1 腎臟解剖觀察 將小鼠腹腔打開，仔細觀察小鼠腎臟大小、形態(tài)、顏色。正常組、模型組和治療組的腎臟大小基本一致，表面光滑、無腫脹、無出血，無明顯差異，模型組腎臟顏色較正常組顏色加深，其他變化不明顯，見圖1。

3.2 腎臟病理學(xué)觀察 HE染色顯示正常組小鼠腎小球、腎小管形狀規(guī)則，腎小管上皮細胞排列整齊，形態(tài)完整，細胞質(zhì)均勻；模型組腎小球內(nèi)皮細胞變性壞死（箭頭所示），腎小管上皮細胞中出現(xiàn)大小不等的空泡，少量腎小管上皮細胞壞死、脫落；治療組腎小球形態(tài)正常，少量腎小管上皮細胞變性壞死，見圖2。

Figure 1.The macroscopic changes of renal tissues.圖1 腎臟大體觀察

Figure 2.HE staining for observing the pathological changes of renal tissues.The scale bar=12.5μm.圖2 腎臟組織HE染色觀察

4 SDG減輕CIH小鼠的腎臟炎癥損傷

4.1 ELISA檢測血清中促炎因子的水平 與正常組相比，模型組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量顯著升高，治療組血清中TNF-α和IL-1β的含量較模型組顯著下降（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平及腎臟組織SOD活性和MDA含量的測定Table 2.The serum levels of inflammatory factors，and the activity of SOD and the content of MDA in the renal tissues of each group（Mean±SD.n=4）

4.2 免疫組織化學(xué)染色檢測腎組織NLRP3蛋白的表達水平 NLRP3蛋白主要表達在腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)，且積分吸光度（integral absorbance，IA）統(tǒng)計結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組NLRP3蛋白的表達量顯著增多（P＜0.05），與模型組相比，治療組NLRP3蛋白表達減少（P＜0.05），說明SDG具有良好的治療作用，見圖3。

4.3 Western blot檢測腎組織NLRP3炎癥小體和炎癥因子的蛋白水平 與正常組相比，模型組NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白上調(diào)，其活化標(biāo)志物IL-1β和IL-18的表達上調(diào)，治療組比模型組顯著降低（P＜0.05），說明SDG可抑制炎癥小體的生成和炎癥因子的表達，見圖4。

5 SDG可抑制CIH小鼠腎組織氧化應(yīng)激

5.1 羥胺法和硫代巴比妥酸法分別檢測SOD的活性和MDA的含量 與正常組相比，模型組MDA的含量增高，模型組SOD的活性較正常組降低（P＜0.05），給予SDG治療后，這2項指標(biāo)有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

5.2 免疫組織化學(xué)染色檢測腎組織TXNIP蛋白的表達量 TXNIP在正常組細胞胞漿內(nèi)表達很少，當(dāng)受到刺激后，模型組細胞胞漿內(nèi)明顯增多，且免疫組化IA統(tǒng)計結(jié)果顯示，治療組胞漿內(nèi)TXNIP表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

5.3 Western blot檢測腎組織TXNIP蛋白的表達量 與正常組相比，模型組TXNIP蛋白表達顯著增多（P＜0.05），治療組與模型組相比顯著減少（P＜0.05），見圖6。

上述結(jié)果說明SDG可降低MDA水平，提高SOD活性，減少TXNIP表達，從而抑制氧化應(yīng)激。

Figure 3 The representative images of immunohistochemical staining for NLRP3 in each group and the analysis of integral absorbance（IA）.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖3 各組小鼠腎臟組織NLRP3蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Figure 4.The protein expression of NLRP3，caspase-1，ASC，IL-18 and IL-1β in each group was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖4 各組小鼠腎臟組織中NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β蛋白表達水平

討 論

Figure 5.The representative images of immunohistochemical staining for TXNIP in each group and the analysis of integral absorbance（IA）.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖5 各組小鼠腎臟組織中TXNIP的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Figure 6.The protein expression of TXNIP in each group was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖6 各組小鼠腎臟組織中TXNIP蛋白的測定

阻塞性睡眠呼吸暫停在臨床中最常見和最典型的癥狀是出現(xiàn)上呼吸道的部分或完全阻塞，從而表現(xiàn)出間歇性低氧的情況，因此有效的緩解間歇性低氧是治療OSA的重中之重。本研究通過建立間歇性低氧模型來模擬中重度OSA，從動物水平研究SDG對CIH模型小鼠腎臟炎癥損傷的作用機制，為OSA的治療提供更有利的理論依據(jù)。CIH作為OSA的主要病理特征，可以引起生物體的氧化應(yīng)激，造成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致OSA病人心、腎等器官的功能損害［7-10］，臨床主要表現(xiàn)為夜間尿量增多、腎功能低下，病理表現(xiàn)為腎小球結(jié)構(gòu)改變、腎小管上皮細胞脫落、壞死，嚴(yán)重者有炎癥細胞浸潤，腎臟纖維化。本研究CIH組的腎臟病理變化明顯，腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管上皮細胞脫落，甚至壞死，與李婷等［9］研究的結(jié)果一致，都是由于長時間的間歇性低氧導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化應(yīng)激造成的。李娟芝等［11］的研究已證實，在動物體內(nèi)，CIH引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的激活，參與足細胞損傷、系膜細胞損傷、腎小管上皮細胞損傷及腎臟纖維化，而抑制ERS的激活可以保護腎臟。Salminen等［12］發(fā)現(xiàn)，動物心、腎等器官發(fā)生缺血再灌注損傷時，線粒體電子傳遞復(fù)合體及氮氧化物酶等會產(chǎn)生大量的ROS，造成機體損傷，而應(yīng)用線粒體特異性的ROS抑制劑，可有效緩解心、腎等臟器缺血再灌注所造成的損傷。也有研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧動物心肌組織中丙二醛水平顯著增加，且超氧化物歧化酶活性顯著降低。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，能夠反映脂質(zhì)過氧化作用的水平。SOD能清除超氧化自由基，防止細胞損傷，它的活性可以直接反映細胞對氧自由基的清除能力，在維持組織細胞氧化和抗氧化平衡中起關(guān)鍵作用［13-14］。本研究通過羥胺法測定CIH小鼠腎臟組織SOD活性，發(fā)現(xiàn)SOD活性下降，表明腎組織細胞清除氧自由基能力下降。同時通過TBA法檢測腎臟組織MDA的含量，發(fā)現(xiàn)MDA含量增高，說明腎臟組織細胞發(fā)生了過氧化，間接反映間歇性低氧誘導(dǎo)了腎組織的氧化應(yīng)激，造成腎臟損傷。

TXNIP是硫氧還蛋白系統(tǒng)中的一員，在正常情況下，TXNIP與氧化型TRX-1結(jié)合抵抗組織細胞氧化應(yīng)激，而當(dāng)機體受到外界病原的氧化刺激，活性氧ROS增多，TRX-1蛋白被還原，由于TRX-1蛋白本身可形成二硫鍵，隨即與TXNIP解離，促使TXNIP與NLRP3結(jié)合，從而激活NLRP3炎癥小體，進一步活化下游信號通路，促進炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放［15］。NLRP3炎癥小體是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成，由模式識別受體NLRP3、ASC及caspase-1組成［16-17］。當(dāng)機體受到內(nèi)源或外源性刺激（如細菌毒素、病毒基因組、氧化應(yīng)激等）時，NLRP3炎癥小體被激活，進而活化下游信號通路，引起機體炎癥反應(yīng)。在本研究中，由于間接性低氧引起的氧化應(yīng)激促使TXNIP與TRX-1解離，與NLRP3結(jié)合，進而激活NLRP3炎癥小體，促進IL-18和IL-1β的成熟與釋放，造成腎臟炎癥損傷。本文通過蛋白免疫印跡實驗得出CIH組中TXNIP和NLRP3的蛋白表達量顯著身高，炎癥因子大量產(chǎn)生，符合間歇性低氧的特征。所以抑制氧化應(yīng)激的藥物可能具有治療特定炎癥性疾病的潛力。

亞麻籽是亞麻科（Linaceae）亞麻屬（Linum）草本植物亞麻的成熟種子，其成分主要包括木酚素、油脂、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、亞麻籽膠、維生素等［18］，其中，含量最高且最主要的是木酚素，其具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管、增強機體免疫力、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和延緩衰老等作用，對人類健康有重要意義。作為天然的抗氧化劑，在醫(yī)藥方面取得很大的突破。Prasad等［19］研究發(fā)現(xiàn)對已形成AS的新西蘭兔模型中，SDG可顯著降低主動脈MDA水平，減少主動脈內(nèi)膜斑塊形成面積。Dupasquier等［20］研究表明，膳食中添加5%的亞麻籽能夠顯著抑制低密度脂蛋白受體缺失小鼠動脈粥樣斑塊的形成。王榮等［6］研究表明SDG對自由基引發(fā)劑AAPH誘導(dǎo)的紅細胞和肝組織氧化損傷有拮抗作用，其作用機制可能是通過保護紅細胞和肝組織內(nèi)抗氧化酶和抑制脂質(zhì)過氧化實現(xiàn)的。由于木酚素獨特的生物活性和多方面的藥理作用，其在炎癥和腫瘤疾病中也取得一些進展。Teponno等［21］等的研究發(fā)現(xiàn)在食物中添加5%SDG能顯著抑制巨噬細胞標(biāo)志物MAC-3以及炎癥因子IL-6和VCAM-1的表達。Zanwar等［22］制備的大鼠心肌壞死模型研究表明，SDG能顯著減輕心肌炎癥。2017年美國國立衛(wèi)生研究院批準(zhǔn)的一項研究顯示，SDG能減少石棉誘導(dǎo)的肺癌細胞的NLRP3炎癥小體的表達和NF-κB的激活，再次證明SDG有明顯的抑炎作用。本研究結(jié)果顯示，CIH引起機體產(chǎn)生過量的活性氧或自由基，造成腎臟發(fā)生氧化損傷，腎組織NLRP3、ASC、IL-18和IL-1β蛋白，以及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α等表達顯著升高，發(fā)生炎癥反應(yīng)；當(dāng)給予SDG治療后，腎臟組織的抗氧化作用增強，病理炎癥反應(yīng)減輕，腎臟損傷明顯減輕。臨床OSA病人的發(fā)病原因和機制非常復(fù)雜，涉及多種反應(yīng)，炎癥在其中發(fā)揮著重要作用，長期炎癥環(huán)境下可使組織細胞損傷，誘導(dǎo)其死亡。本研究得出由于CIH所造成腎臟發(fā)生炎癥損傷的作用機制可能與TXNIP-NLRP3信號通路有關(guān)。

綜上所述，SDG能有效減輕CIH小鼠腎臟炎癥損傷，其作用機制與抗氧化、抑制炎癥有關(guān)。本研究為臨床治療OSA提供了新的思路。