CYP450表氧化酶/EET代謝途徑通過HIF-1α減輕肥胖小鼠脂肪炎癥*

焉曉乘， 牟維娜， 強 曄， 趙蕙琛， 孫 琦，2， 姚曉敏，3， 張玉超， 劉元濤△

（1青島大學醫學院附屬青島市市立醫院內分泌科，山東青島266011；2青島市膠州中心醫院內分泌科，山東青島266300；3日照市人民醫院內分泌科，山東日照276826）

目前糖尿病及肥胖呈全球流行趨勢。肥胖與糖尿病密切相關，其病理生理機制尚不清楚，因此，脂肪組織生物學的研究引起廣泛關注。研究證實脂肪組織不僅是惰性的脂肪儲存庫，還是重要的內分泌器官［1］，可通過自分泌及旁分泌的方式釋放多種細胞因子［2］，參與局部和系統的代謝及炎癥過程，調節外周組織對胰島素的敏感性，參與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的發生發展［3］。同時，脂肪細胞過度膨脹，導致脂肪組織內出現缺氧微環境，誘導脂肪細胞與巨噬細胞表達促炎癥因子、巨噬細胞浸潤、脂肪細胞壞死等，進一步加重脂肪組織的炎癥程度。

環氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）為花生四烯酸（arachidonic acid，AA）經細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）表氧化酶催化生成的代謝產物［4-5］，其中 11，12-EET 和 14，15-EET是多數細胞和血管中EETs的主要存在形式，具廣泛的生物效應，如抗炎及促進血管再生［6-7］。我們的前期研究證實，糖尿病小鼠組織中CYP450表氧化酶CYP2J2表達顯著降低，EETs可顯著促進糖尿病小鼠血管再生，抑制組織炎癥反應［8］。還有研究提示EETs在肥胖和IR等方面發揮重要作用［9］。CYP2J2/EET途徑在IR中的作用日益受到關注［10］，但是相關機制目前國內研究較少。根據已有研究，我們推測CYP450/EET代謝通路可能通過促進血管生成作用減輕肥胖誘導的慢性炎癥及IR，并通過設計動物實驗進行驗證。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠40只，3周齡，體重（19±1）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。每籠5只飼養在SPF級動物房中，每日光照12 h。自由飲食飲水。

2 主要試劑

11，12-EET 和 14，15-環氧二十碳-5（Z）-烯酸［epoxyeicosa-5（Z）-enoic acid，EEZE］購于 Cayman；兔抗 CD31（1∶300）購于 Abcam；兔抗 CYP2J2（1∶1 000）、鼠抗GAPDH（1∶5 000）及小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1 ELISA試劑盒購于Proteintech；鼠抗低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α；1∶500）購于EMD Millipore；Phosphatase Inhibitor Cocktail（100×）購于 Cell Signaling Technology；小鼠胰島素高敏ELISA試劑盒購于Arigo Biolaboratories。

3 主要方法

3.1 肥胖模型構建及分組 將小鼠分為普通飼料組和高脂飼料組，分別喂飼普通飼料和高脂飼料（脂肪提供熱量的40%）。每7 d測定小鼠體重，當高脂飼料組小鼠體重超過普通飼料組小鼠30%，確定為肥胖小鼠成功建模。將肥胖小鼠又隨機分為：肥胖（obesity，OB）組（生理鹽水腹腔注射，n=10）、EET組（0.1 g·kg-1·d-111，12-EET 腹 腔 注 射 ，n=10）［11］和EEZE組（0.1 g·kg-1·d-114，15-EEZE腹腔注射，n=10）［12］。普通飼料組小鼠腹腔注射等量生理鹽水作為正常對照（normal control，NC）組（n=10）。干預第7天禁食8 h后于眼眶靜脈叢取血，靜置30 min后分離血清。最后處死小鼠，取附睪和腎周脂肪置于4%組織細胞固定液固定或液氮內保存。

3.2 ELISA實驗測定小鼠血清炎癥因子水平 參照ELISA試劑盒說明書，按順序加入小鼠血清和試劑盒試劑孵育，洗板后加入檢測抗體孵育1 h，加入鏈霉素親和的辣根過氧化物酶抗體孵育，最后加顯色底物。加入終止溶液終止反應后立即使用酶標儀讀取波長450 nm的吸光度（A）。用ELISA Calc軟件擬合出標準曲線，以標準品的A值為縱坐標，濃度為橫坐標。回歸分析求出最好的擬合曲線，濃度和A值取對數擬合。依照擬合的回歸曲線來求出小鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

3.3 胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）的測定 根據ELISA試劑盒說明書對血清樣品進行處理，計算小鼠血清胰島素水平。HOMA-IR=空腹血糖水平（mmol/L）×空腹胰島素水平（mU/L）/22.5。

3.4 Western blot實驗 用預冷的RIPA裂解液提取附睪脂肪組織蛋白。應用10%SDS-PEAG后，轉模1.5 h，室溫脫脂牛奶封閉1 h，4℃I抗孵育過夜，室溫II抗孵育1 h，充分洗膜后ECL顯像。ImageJ 1.42定量分析結果。

3.5 免疫組化分析 脂肪組織經脫水、石蠟包埋、切片（組織厚度為5μm）、脫蠟和水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉后，加入I抗4℃孵育過夜，室溫II抗孵育50 min，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水封片，顯微鏡鏡檢拍照并掃描圖片，DAB標記陽性結果顯示棕黃色。用QuantCenter 2.1軟件（3DHISTECH）分析抗體陽性表達程度，使用組織化學評分（histochemistry score，H-SCORE）對組織染色進行半定量分析。組織學評分方法：將每張切片內陽性的細胞數量及其染色強度轉化為相應的數值。H-SCORE=（percentage of cells of weak intensity×1）+（percentage of cells of moderate intensity × 2）+（percentage of cells of strong intensity× 3）。

3.6 RT-qPCR檢測脂肪組織HIF-1α的mRNA水平 取10 mg附睪脂肪組織，嚴格按照試劑盒說明書進行操作提取總RNA，測定濃度后反轉錄為cDNA，加入擴增反應體系運用RT-qPCR法擴增，40個循環結束后采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，檢測目的基因的mRNA相對表達水平。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR相關引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

4 統計學處理

采用SPSS 1.0.0.1246軟件統計分析，各測定值以均數±標準差（mean±SD）表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 EET可以降低肥胖小鼠胰島素抵抗水平

與NC組相比，OB組HOMA-IR顯著升高（P＜0.05）；與OB組相比，EET組HOMA-IR顯著降低（P＜0.01），EEZE組HOMA-IR無顯著差異；EEZE組HOMA-IR顯著高于EET組（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Treatment with EET attenuated insulin resistance in obese mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs OB group；&&P＜0.01 vs EET group.圖1 EET可以降低肥胖小鼠胰島素抵抗水平

2 肥胖小鼠CYP2J2蛋白表達水平顯著降低

Western blot結果顯示，OB、EET和EEZE組小鼠附睪脂肪組織CYP2J2蛋白表達水平均較NC組顯著降低（P＜0.01），其余組間兩兩比較差異無統計學意義，見圖2。

Figure 2 The protein expression levels of CYP2J2 in epididymal adipose tissues of obese mice were significantly reduced compared with normal C57BL/6JCnc mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group.圖2 肥胖小鼠CYP2J2蛋白表達水平顯著降低

3 EET可以減輕肥胖小鼠脂肪組織缺氧程度

為評估各組小鼠組織缺氧程度，我們檢測了小鼠附睪脂肪組織中HIF-1α蛋白的水平。與NC組相比，OB組HIF-1α表達水平顯著升高（P＜0.01）；與OB組相比，EET組HIF-1α蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與EET組相比，EEZE組HIF-1α蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），見圖3A。但4組小鼠附睪脂肪組織HIF-1α mRNA水平無顯著差異，見圖3B。

Figure 3.Treatment with EET attenuated the anoxic conditions in epididymal adipose tissues of obese mice.A：Western blot for determining the protein level of HIF-1α；B：real-time PCR for determining the mRNA level of HIF-1α.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs OB group；&&P＜0.01 vs EET group.圖3 EET可以減輕肥胖小鼠脂肪組織缺氧程度

4 EET可降低肥胖小鼠體內炎癥因子水平

檢測小鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β水平，結果顯示，OB組小鼠血清炎癥因子水平顯著高于NC組（P＜0.05）；EET干預7 d后，小鼠血清中4種炎癥因子水平與OB組相比顯著下降（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Administration of exogenous EET resulted in reduced production of inflammatory cytokines in the serum of obese mice.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs OB group.圖4 EET可以降低肥胖小鼠體內炎癥因子水平

5 EET可以促進肥胖小鼠脂肪組織血管生成

使用CD31標記附睪脂肪組織中血管樣組織以檢測EET干預后小鼠附睪脂肪組織的血管生成情況。CD31染色如圖5箭頭所示，與NC組比較，OB組CD31蛋白量減少，EET組CD31染色水平接近NC組。圖像統計分析結果顯示，在藥物干預第7天，與NC組相比，OB組小鼠的H-SCORE顯著降低（P＜0.05），EET組H-SCORE值與NC組持平；與OB組相比，EET組H-SCORE顯著升高（P＜0.05）。

Figure 5.EET promoted angiogenesis in epididymal adipose tissues of obese mice.At day 7 after drug treatment，vessel-like structures（CD31-positive）in epididymal adipose tissues were observed by immunohistochemistry（left：scale bar=500 μm；right：scale bar=50 μm），and histochemistry score（H-SCORE）of CD31 was calculated.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs OB group.圖5 EET可以促進肥胖小鼠脂肪組織血管生成

討 論

既往研究表明CYP450/EET途徑對胰腺細胞功能及外周組織對胰島素的敏感性有重要影響。5，6-EET可刺激大鼠離體胰島分泌胰島素，過表達CYP2J2或可溶性環氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）抑制劑可顯著減輕小鼠外周IR及代謝功能障礙［13-15］。臨床研究顯示，2型糖尿病患者循環EET代謝產物的血漿濃度是降低的［16］；大鼠實驗研究顯示，高脂飲食誘導肥胖大鼠腎臟CYP450表達降低［17］，提示CYP450/EET途徑障礙可能與糖尿病的發生及進展有關。肥胖（尤其是向心性肥胖）是糖尿病發生的重要危險因素之一。目前研究認為肥胖狀態下，脂肪炎癥可能是導致IR的重要原因，但具體機制尚不明確。本研究旨在探索CYP450/EET通路與肥胖誘導的脂肪炎癥及IR的關系并探討其機制。

大量證據表明，炎癥是IR的重要原因。炎癥因子通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）系統，抑制胰島素的磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）通路，干擾胰島素信號轉導，導致IR［18］。巨噬細胞和白細胞代謝生成的細胞因子（如TNF-α等）可激活內皮細胞，促進細胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）的表達，而CAMs是一類位于細胞膜表面的糖蛋白，是炎癥的誘導劑［19］。有研究報道，11，12-EET是對血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達最強的抑制劑［20］。NF-κB是一種廣泛存在于各種細胞中的轉錄因子，因其能與免疫球蛋白κ鏈基因增強子結合而得名。激活的NF-κB可促進許多致炎因子的轉錄和表達，被作為炎癥治療的“靶點”。另有研究表明，sEH抑制劑可抑制NF-κB活性，減少炎癥細胞浸潤［21］。注射外源性EETs可抑制NF-κB的活化和轉位，從而顯著抑制TNF-α誘導的小鼠頸動脈內皮細胞VCAM-1的表達，減少單核細胞對內皮細胞的黏附［20］。缺氧條件下，CYP2J3/EETs可能通過抑制caspase-3蛋白表達及活性調節心肌細胞活力［22］，而11，12-EET可激活肝臟細胞與動脈內皮細胞內缺氧反應元件的啟動子活性，誘導HIF-1α穩定表達。可見，CYP450/EET通路與缺氧導致炎癥反應有關［23］。

為探討CYP450/EET代謝通路與肥胖誘導的脂肪組織炎癥的關系，我們首先檢測了CYP450表氧化酶在肥胖小鼠脂肪組織中的表達，其中CYP2J2蛋白表達水平顯著降低。為明確CYP2J2下調與脂肪炎癥的相關性，我們觀察了外源性EET對脂肪炎癥的影響，結果顯示肥胖小鼠脂肪組織中炎癥因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-β表達顯著增多，外源性11，12-EET治療可以顯著降低脂肪組織中炎癥因子的表達水平，而EET拮抗劑14，15-EEZE則導致各種炎癥因子顯著增加。以上結果提示CYP450表氧化酶表達減少可能是肥胖狀態下脂肪炎癥的重要因素之一。

缺氧是導致炎癥的重要因素之一。本研究觀察到，與正常小鼠相比，肥胖小鼠附睪脂肪組織中HIF-1α蛋白表達水平升高，提示肥胖誘導的脂肪炎癥可能與缺氧有關。為探討CYP450/EET對炎癥的影響機制，我們觀察了外源性EET對血管形成及缺氧的影響。結果顯示，EET干預的肥胖小鼠脂肪組織中CD31陽性率顯著增增加，而HIF-1α蛋白表達顯著下降。上述結果提示，EET可通過促進脂肪組織血管生成，緩解缺氧，從而抑制組織炎癥。

綜上所述，本研究提示CYP450表氧化酶低表達可能是肥胖誘導IR的重要原因，外源性EET可顯著減輕肥胖導致的IR，其作用機制可能與促進血管生成、緩解缺氧、減輕炎癥有關。