布比卡因介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后修復(fù)通路的激活*

駱佳銘， 李 機(jī)， 徐世元， 趙 偉

（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510282）

局麻藥（local anesthetics）是臨床局部麻醉和疼痛治療的常用藥物，但其高濃度或長期作用于神經(jīng)周圍時，會誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷反應(yīng)［1］。神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)機(jī)制多種多樣，其中神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)直接關(guān)系到神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)而備受關(guān)注，目前局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷后DNA損傷的修復(fù)機(jī)制尚未明確［2］。

有證據(jù)表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的重要因素之一［3］。DNA損傷的類型多種多樣，損傷后的DNA會啟動相關(guān)的損傷修復(fù)信號通路［4］。而氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞DNA的損傷主要是以氧化型堿基損傷居多，該類DNA氧化損傷主要是通過切除修復(fù)機(jī)制完成修復(fù)，如DNA堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）和核酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）［5］。局麻藥布比卡因（bupivacaine）也可通過細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激爆發(fā)造成神經(jīng)細(xì)胞的DNA損傷誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡甚至壞死，由此引起神經(jīng)功能并發(fā)癥［6-7］。布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞DNA損傷后哪些修復(fù)通路參與國內(nèi)外尚未見報道。

本研究首先建立布比卡因?qū)е碌腟H-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷模型，再應(yīng)用cDNA微孔板陣列技術(shù)進(jìn)行DNA損傷修復(fù)通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復(fù)酶的基因篩查。通過cDNA微孔板對21個DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)譜的篩查，再通過信息分析得到相關(guān)的DNA損傷修復(fù)通路的激活情況。明確布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞DNA損傷后哪些修復(fù)通路參與，可為臨床上防治該類局麻藥的神經(jīng)毒性損傷選擇新的靶點治療藥物提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

實驗用SH-SY5Y細(xì)胞系購買于中科院上海細(xì)胞庫。鹽酸布比卡因（純度＞99%）購買于Sigma-Aldrich；彗星實驗試劑盒CometAssay?購買于美國GENMED；CCK-8試劑盒購買于日本同仁公司；Western blot實驗用抗β-tubulin和p-γH2AX抗體購買于CST；抗兔/鼠 II抗購買于Bioworld Technology；cDNA微孔板陣列實驗試劑盒購買于Signosis。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞后活力的變化 將SH-SY5Y細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液后并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×108/L，接種細(xì)胞于96孔板中（即每孔細(xì)胞約為1×104個）。細(xì)胞貼壁24 h后，用含0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L布比卡因的培養(yǎng)基處理細(xì)胞3 h后，換成正常培養(yǎng)基孵育24 h。向各孔中加入10μL的CCK-8溶液，再37℃孵育4 h后，酶標(biāo)儀讀板，測定450 nm處的A值。細(xì)胞活力（%）=［加藥-空白組A值］/［0加藥-空白］×100%。

2.2 彗星實驗檢測布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞后DNA的損傷情況 布比卡因的IC50值濃度處理SHSY5Y細(xì)胞3 h后，換成正常培養(yǎng)基再孵育24 h作為損傷模型組，對照組不用布比卡因處理。將分組處理好的細(xì)胞用PBS漂洗1遍，重懸后38°C水浴待用，然后用低熔點瓊脂糖凝膠與預(yù)處理的細(xì)胞懸液混合后均勻鋪在彗星玻璃板（每孔20μL）；待細(xì)胞凝膠完全冷卻后進(jìn)行裂解、解旋、水平電泳后輕輕漂洗2次再避光靜置10 min后染色，熒光顯微鏡下觀察PI染色的細(xì)胞核圖象呈紅色熒光，通過觀察發(fā)現(xiàn)核DNA（彗星頭部）呈紅色圓球形和遷移的DNA（即慧星尾）呈散在的拖尾。每個實驗分組隨機(jī)選擇50個彗星圖像觀察并記錄，并用相應(yīng)的軟件分析分析彗星實驗的相關(guān)指標(biāo)如Olive tail moment。DNA損傷按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級：＜5%無損傷者為0級；5%～20%輕度損傷者為1級；20%～40%中度損傷者為2級；40%～95%高度損傷者為3級；＞95%重度損傷者位4級。

2.3 Western blot檢測DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)取各組處理后的6孔板細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌3次后加入100μL含10%PMSF和5%磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（使用前5 min配制）低溫離心取蛋白上清液后，進(jìn)行蛋白定量。上樣后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完成后再用200 mA恒定電流進(jìn)行0.2μm PVDF轉(zhuǎn)膜90 min，封閉1 h，繼續(xù)孵I抗過夜，TBST緩沖液清洗3次后，室溫下孵II抗1 h，再次用TBST清洗3次，化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。用Image J軟件分析照片中蛋白的A值，以目的蛋白A值/內(nèi)參蛋白β-tubulin A值的比值反映目的蛋白相對表達(dá)水平。

2.4 cDNA微孔板陣列技術(shù)篩查DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因 首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞SHSY5Y毒性損傷模型，再應(yīng)用cDNA微孔板陣列技術(shù)做關(guān)于DNA損傷修復(fù)通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復(fù)酶的基因篩查如：DNA損傷修復(fù)從損傷的應(yīng)答（DNA damage respond，DDR），損傷部位的識別（DNA recognition），再到修復(fù)（DNA repair）的過程，每一個步驟都有其起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因。檢測的基因 目 錄 包 括 ：（1）DDR：ATM、ATR、DNA-PKcs、Rad50（MRN complex）、BRCA1、CHK2、p21、P53和PTEN（phosphatase and tensin homolog）、GADD45、RAD9、NBS1；（2） DNA recognition：DDB、XPCHR23B；（3）DNA repair：OGG1、NTH1、CSB、XPA、XPD、TFIIH和MLH1。

采用Signosis的專利產(chǎn)品cDNA微孔板陣列［8］，它是基于微孔板雜交原理的一種檢測方法，其是通過將生物體內(nèi)的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后來達(dá)到檢測多種基因表達(dá)的目的，可高度敏感度地定量甚至定性檢測目的基因的表達(dá)水平，同時還可以比較不同樣本之間的特定基因表達(dá)水平的差異［8］。

cDNA微孔板為96孔，每組Sample安排3列，按照陣列實驗的設(shè)計Sample 1和Sample 2是對照C（control）組，Sample 3和Sample 4為布比卡因處理組（模型組）。

6孔板培養(yǎng)的正常組和布比卡因處理組細(xì)胞用Trizol reagent（GIBCO BRL）抽 提 細(xì) 胞 總 RNA，用QuickPrep Micro mRNA純化試劑盒分離純化總RNA中的mRNA。本實驗采用Signosis公司。探針的制備和雜交按照試劑盒用戶手冊中提供的方法和試劑操作。總RNA先轉(zhuǎn)錄成生物素標(biāo)記的cDNA。通過預(yù)包被在微孔板上的特異的寡核酸，將靶基因捕獲到微孔板上（而不是膜上）。捕獲的cDNA進(jìn)一步通過鏈酶親和素辣根酶（HRP）檢測。加入HRP發(fā)光底物，cDNA的濃度與待測標(biāo)本的發(fā)光強(qiáng)度成正比。檢測板置于化學(xué)發(fā)光檢測儀上進(jìn)行相對光單位（RLU）測定。

兩次實驗結(jié)果的均值進(jìn)行以下數(shù)據(jù)處理，并做柱狀圖：（1）Blank對數(shù)據(jù)進(jìn)行normalization（每個指標(biāo)的RLU減去blank均值）；（2）β-actin對數(shù)據(jù)進(jìn)行normalization，步驟（1）處理后的數(shù)據(jù)中，每個樣本除β-actin和blank之外的指標(biāo)與β-actin其RLU數(shù)值做比值；（3）需要兩兩比較的樣本，對應(yīng)指標(biāo)做比值，并以底數(shù)2求對數(shù)，即可得到relative mRNA expression（log2 ratio），并做柱狀圖。以上數(shù)據(jù)處理及繪圖均在Excel軟件中進(jìn)行。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有實驗均獨立重復(fù)至少3次（n≥3），實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組之間的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度梯度的布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞后細(xì)胞活力的變化

分別用含0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L布比卡因的培養(yǎng)基處理細(xì)胞3 h后，換成正常培養(yǎng)基孵育24 h，采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力。結(jié)果顯示：通過CCK-8檢測不同濃度布比卡因處理細(xì)胞后，布比卡因的IC50值為1.5 mmol/L，見圖1。

Figure 1.The effect of different concentrations of bupivacaine on SH-SY5Y cell viability.Mean±SD.n=5.圖1 不同濃度布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞生長活力抑制作用

2 布比卡因致SH-SY5Y細(xì)胞DNA損傷加重

彗星實驗（comet assay）是一種比較理想的單細(xì)胞水平檢測哺乳類有核細(xì)胞DNA損傷的技術(shù)［9］。結(jié)果顯示，與對照組比較，布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞組的DNA損傷明顯加重，彗星實驗相關(guān)損傷指標(biāo)彗星尾部DNA比例（Tail DNA%）和尾距（Olive tail moment）明顯增高，而彗星頭部DNA比例明顯降低（P＜0.01），見圖2。γH2AX蛋白的磷酸化水平是DNA損傷的一個新的特異性指標(biāo)［10］，與對照組比較，布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞組的γH2AX磷酸化水平明顯增高（P＜0.05），見圖3。

3 cDNA微孔板陣列技術(shù)檢測結(jié)果

首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞SH-SY5Y毒性損傷模型，再應(yīng)用cDNA微孔板陣列技術(shù)做關(guān)于DNA損傷修復(fù)通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復(fù)酶的基因篩查，見圖4、5。

4 布比卡因造成的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)途徑分析

Figure 2.DNA damage after treatment of SH-SY5Y cells with bupivacaine at IC50value of 1.5 mmol/L.Compared withcontrol group，the proportion of DNA in the tail of the comet assay inbupivacaine group（Tail DNA%）and the tail tail（Olive tail moment）were significantly increased，while the proportion of DNA in the head of the comet was significantly reduced.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖2 布比卡因IC50值1.5 mmol/L濃度處理SH-SY5Y細(xì)胞后DNA損傷情況

如表1所示，通過cDNA微孔板對21個DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)譜的篩查，我們發(fā)現(xiàn)局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后差異表達(dá)的修復(fù)基因主要集中在以下3修復(fù)通路：（1）堿基切除修復(fù)（base excision repair）；（2）核酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair）；（3）.非同源重組修復(fù)（Non-homologous end-joining）。以上信號通路信息分析來自于KEEG Pathway Database數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）。

討 論

局麻藥是臨床上局部麻醉和疼痛治療的常用藥物之一，但該類藥物突然高濃度或長期作用于神經(jīng)周圍時，可能會誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷反應(yīng)。局麻藥的種類、劑量和時間等可影響局麻藥的神經(jīng)毒性，作用機(jī)制可能與局麻藥影響細(xì)胞膜鈣離子通道、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與炎性反應(yīng)等相關(guān)［11-12］。神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)機(jī)制多種多樣，其中神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)直接關(guān)系到神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)而備受關(guān)注。

Figure 3.Western blot analysis of DNA damage-related protein expression after treatment of SH-SY5Y cells with bupivacaine at 1.5 mmol/L.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖3 Western blot檢測1.5 mmol/L布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞后DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)

生物體DNA頻繁接受體內(nèi)與外環(huán)境中有害因素的威脅，但機(jī)體存在一套完整的DNA損傷后應(yīng)答機(jī)制［13］。當(dāng)機(jī)體DNA損傷發(fā)生損傷后會激活細(xì)胞周期“防火墻”（cell cycle checkpoint），該“防火墻”就像汽車的剎車系統(tǒng)一樣，可暫時阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，而且還會激活相關(guān)的修復(fù)通路對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)［14］，但如果DNA損傷無法完全被修復(fù)的話，則會引起細(xì)胞凋亡甚至死亡［15］。

由于危險因素的種類和作用機(jī)制不同，DNA損傷的類型也是多種多樣，損傷后的DNA會啟動相關(guān)的損傷修復(fù)信號通路［4］。氧化應(yīng)激/ROS導(dǎo)致的細(xì)胞DNA的損傷主要是以氧化型堿基損傷居多，應(yīng)對這類氧化損傷主要是通過切除修復(fù)機(jī)制完成修復(fù)，如：DNA堿基切除修復(fù)和核酸切除修復(fù)［16］。局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后與上述修復(fù)通路關(guān)系如何及其修復(fù)能力的強(qiáng)弱國內(nèi)外尚未見報道。

有證據(jù)表明，氧化應(yīng)激/ROS是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的重要因素之一［17］。前期我們的研究也已證實了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激/ROS爆發(fā)是局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷的重要機(jī)制之一［6-7］。因此，局麻藥也可能通過細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激爆發(fā)造成神經(jīng)細(xì)胞的DNA損傷，由此引起神經(jīng)功能并發(fā)癥！DNA損傷類型多種多樣，損傷后的DNA會啟動相應(yīng)的修復(fù)機(jī)制［4］。

Figure 4.The results of 21 DNA damage repair related genesanalyzed by cDNA microplate array.The value was above 0 represented up-regulated genes，while that was below 0 represented down-regulated genes after bupivacaine treatment.圖4 應(yīng)用cDNA微孔板陣列技術(shù)分析了21個DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因

Figure 5.The results of cDNA microplate arrays，in which differentially up-regulated DNA damage repair related genes were showed.圖5 cDNA微孔板陣列的結(jié)果

DNA損傷修復(fù)從損傷的應(yīng)答（DNA damage response）、損傷部位的識別（DNA recognition），再到修復(fù)（DNA repair）的過程，每一個步驟都有其起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因［18］。因此，針對布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)，可能有幾十甚至上百種修復(fù)酶參與該過程，這是一個龐大而且復(fù)雜的修復(fù)機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。cDNA微陣列技術(shù)可高敏感度檢測不同處理組之間基因表達(dá)水平的差異［19］。本研究首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞SH-SY5Y毒性損傷模型，再應(yīng)用cDNA微孔板陣列技術(shù)做關(guān)于DNA損傷修復(fù)通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復(fù)酶的基因篩查。通過cDNA微孔板對21個DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)譜的篩查，我們發(fā)現(xiàn)局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后差異表達(dá)的修復(fù)基因主要集中在以下3條修復(fù)機(jī)制：（1）非同源末端修復(fù)；（2）堿基切除修復(fù)；（3）核酸切除修復(fù)。然而，由于現(xiàn)有cDNA微孔板產(chǎn)品技術(shù)的限制，我們暫不能把所有DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因全部篩查，而只能根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道的DNA損傷修復(fù)過程中可能涉及到的關(guān)鍵修復(fù)基因作為本研究的篩選對象。這也正是本研究的局限性和不足之處。

本研究中我們探討了局麻藥布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)基因水平的激活情況，可為臨床上防治該類局麻藥的神經(jīng)毒性損傷選擇新的靶點治療藥物提供理論依據(jù)。但眾所周知，蛋白質(zhì)才是細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)功能主要執(zhí)行者。局麻藥布比卡因?qū)е律窠?jīng)細(xì)胞DNA損傷后哪些修復(fù)蛋白和修復(fù)通路會被激活？這些修復(fù)蛋白的激活與基因水平激活情況又是否存在差異？值得我們進(jìn)一步研究。

表1 顯示差異表達(dá)的修復(fù)基因通過數(shù)據(jù)庫比對后所富集的修復(fù)通路Table 1.The repair pathways of differentially expressed repair genes enriched by database alignment