辛伐他汀通過NF-κB p65通路影響食管癌細胞增殖*

張月曉， 李 萍， 李炳慶， 陳 健

（承德醫學院附屬醫院消化內科，河北承德067000）

食管癌（esophageal cancer，EC）是一種常見的消化系統惡性腫瘤，我國是食管癌高發國家，其發病率及死亡率均居世界第1位，5年生存率僅為15%～34%，嚴重威脅人類健康［1］。手術治療為主，放化療和生物治療為輔是目前癌癥治療的主要方案，但由于食管癌早期癥狀不明顯，確診時多已進入中晚期，因此多數只能采用化療為治療手段，但化療藥物價格昂貴，易產生耐藥性且毒副作用大，效果不理想，因此尋找廉價、毒副作用小的抗腫瘤藥物迫在眉睫［2］。辛伐他汀（simvastatin，SIM）屬于他汀類家族藥物，對心血管疾病的預防及治療效果顯著，還可防治腫瘤，抑制子宮內膜癌和結腸癌等多種腫瘤細胞增殖、促進其凋亡［3-5］。NF-κB通路是一條炎癥相關信號通路，可調控細胞生長、增殖、凋亡及炎癥和免疫應答等生理病理反應。NF-κB是該通路中關鍵性轉錄因子，NF-κB家族中以RelA（p65）研究最為深入［6］。研究報道，SIM可通過調節SIRT2/NF-κB信號通路改善急性肺栓塞大鼠低氧血癥并減輕其炎癥反應，可通過上調NF-κB p65表達降低內毒素誘導的心肌細胞凋亡［7-8］，還可聯合NF-κB信號通路抑制劑促進前列腺癌細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用［9］，但SIM對食管癌細胞的作用尚鮮有研究。因此本研究擬探究SIM對食管癌Eca109細胞增殖及NF-κB p65通路的影響。現報道如下。

材料和方法

1 細胞株、主要試劑及儀器

食管癌Eca109細胞系（ATCC）；辛伐他汀（上海源葉生物科技有限公司）；RPMI-1640培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibco；亞細胞結構胞核與胞漿蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）和MTT試劑盒（Sigma）；兔源NF-κB p65和IκB-α抗體（Abcam）；兔源GAPDH、c-Myc抗體、鼠源cyclin D1抗體、IL-6 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、羊抗兔Ⅱ抗、羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG（Invitrogen）。MODEL550型酶標儀、CO2培養箱（Thermo）；IX73倒置熒光顯微鏡（Olympus）等。

2 方法

2.1 細胞培養及藥物制備 將食管癌Eca109細胞復蘇后用含10%FBS、1%青-鏈霉素的RPMI-1640細胞培養液于37℃、5%CO2培養箱中培養。用0.25%胰蛋白酶消化食管癌Eca109細胞進行傳代。用0.1%DMSO溶解SIM定容至50μmol/L，-20℃儲存備用，處理細胞時采用含0.1%DMSO的生長培養基稀釋。

2.2 MTT法檢測食管癌Eca109細胞活力 將對數期食管癌Eca109細胞接種于96孔細胞板，接種密度約每孔5×104個，每孔添加培養液200μL。細胞完全貼壁后更換培養基并添加終濃度為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L的SIM處理，另設無任何添加的食管癌Eca109細胞為正常對照組（normal control，NC）組，每組6個復孔，分別培養24 h、48 h和72 h。培養結束后用MTT試劑盒檢測各孔細胞活力，具體操作嚴格按照說明書進行。細胞活力抑制率（%）=（1-ASIM組/ANC組）×100%。

2.3 平板集落形成實驗 將對數期食管癌Eca109細胞消化、計數后以每孔200個接種于6孔板，12 h貼壁后更換培養基并添加終濃度為8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L的SIM處理48 h，另設NC組，每組6個復孔。放置于37℃、5%CO2培養箱培養2周，直至出現肉眼可見的細胞集落。甲醛固定后，瑞士染色液染色，隨機選取5個視野，倒置顯微鏡下觀察，細胞數＞50個的平均細胞團數作為集落計數，實驗重復3次（%）。平板集落形成率（%）=（平均集落數/每孔加入單細胞數）×100%。

2.4 Western blot檢測食管癌Eca109細胞中cyclin D1、c-Myc及p65、IκB-α蛋白的表達 收集方法2.3中各組食管癌Eca109細胞，嚴格按照試劑盒操作說明分別提取細胞核和細胞漿蛋白，測定蛋白濃度后，置于-80℃保存備用。取60μg蛋白樣品行6%SDSPAGE分離蛋白，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的I抗（cyclin D1、c-Myc和IκB-α抗體均1∶200，NF-κB p65抗體1∶200，GAPDH抗體1∶500）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次20 min，適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，洗膜，顯色，曝光壓片，觀察結果并進行分析。

2.5 ELISA檢測細胞培養上清液中TNF-α和IL-6的水平 具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。檢測重復4次。

3 統計學處理

用SPSS 20.0進行統計學分析。食管癌Eca109細胞活力抑制率、集落形成率及各蛋白含量為計量資料，符合正態分布，以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SIM對食管癌Eca109細胞活力的影響

與NC組比較，0.1%DMSO對食管癌Eca109細胞活力的抑制作用較小，且各時點抑制率比較無顯著差異（P＞0.05）；2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L和16μmol/L SIM抑制食管癌Eca109細胞活力的作用呈濃度及時間依賴性增加（P＜0.05），同一時間，16μmol/L和32μmol/L SIM對食管癌Eca109細胞活力的抑制率無顯著差異（P＞0.05）。16μmol/L SIM作用食管癌細胞48 h其活力抑制率為50.61%，表明此濃度接近半數抑制濃度（IC50），因此選用8、16和32μmol/L濃度及48 h為后續實驗的條件。詳見表1。

表1 不同濃度SIM對食管癌Eca109細胞活力的影響Table 1.The effects of different concentrations of SIM on viability of esophageal carcinoma Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

2 SIM對食管癌Eca109細胞平板集落形成率的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細胞平板集落形成率依次減少（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細胞平板集落形成率比較，差異無統計學顯著性（P＞0.05），見圖1、表2。

Figure 1.The effect of SIM on flatbed colony formation rate of esophageal carcinoma Eca109 cells.圖1 SIM對食管癌Eca109細胞平板集落形成率的影響

3 SIM對食管癌Eca109細胞增殖相關蛋白cyclin D1和c-Myc蛋白的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細胞中cyclin D1和c-Myc蛋白表達減少（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細胞cyclin D1和c-Myc蛋白水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表2。

Figure 2.The expression of cyclin D1 and c-Myc in Eca109 cells detected by Western blot.圖2 Western blot檢測食管癌Eca109細胞cyclin D1和c-Myc蛋白的表達

4 SIM對食管癌Eca109細胞NF-κB p65通路相關蛋白的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細胞上清中胞核p65蛋白表達依次減少，胞漿p65蛋白和IκB-α蛋白表達依次增加（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細胞胞漿、胞核p65和IκB-α蛋白水平比較，差異均無統計學顯著性（P＞0.05），見圖3、表3。

表2 SIM對食管癌Eca109細胞增殖相關蛋白cyclin D1、c-Myc蛋白表達和集落形成率的影響Table 2.The effects of SIM on the expression of proliferation-related proteins cyclin D1 and c-Myc and the colony formation rate of esophageal cancer Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

表3 SIM對食管癌Eca109細胞NF-κB p65通路相關蛋白的影響Table 3.The effects of SIM on NF-κB p65 pathway related proteins in esophageal carcinoma Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

5 SIM對食管癌Eca109細胞TNF-α和IL-6水平的影響

與NC組比較，SIM 8μmol/L和16μmol/L處理組食管癌Eca109細胞上清中TNF-α和IL-6水平依次減少（P＜0.05），SIM 16μmol/L和32μmol/L處理組食管癌Eca109細胞上清中TNF-α、IL-6水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

討 論

大量研究證實，辛伐他汀參與腫瘤細胞增殖、凋亡等生理過程，在腫瘤防治中發揮重要作用。Buranrat等［10］研究報道，SIM可通過線粒體途徑促進人膽管癌CAA細胞凋亡，抑制其遷移。Wang等［11］研究報道，SIM可通過上調人肝癌HepG2細胞p27和p21表達抑制STAT3/SKP2軸，激活AMPK通路，誘導人肝癌HepG2細胞G0/G1期阻滯，抑制其增殖。金迎迎等［12］研究報道，SIM可通過抑制PI3K/AKT通路，抑制放療引發的食管癌EC9706細胞上皮間充質細胞轉化過程，增加食管癌EC9706細胞的放療敏感性，抑制其增殖、降低其集落存活分數，促進其凋亡。c-Myc基因在正常組織中不表達或低表達，cyclin D1蛋白是一種G1/S特異性周期蛋白，在惡性腫瘤中高表達，可促進腫瘤細胞增殖及惡變。本研究結果發現，與NC組比較，SIM可顯著抑制食管癌Eca109細胞增殖，減少其集落形成率，下調cyclin D1和c-Myc蛋白表達，提示SIM可能通過下調cyclin D1和c-Myc蛋白抑制食管癌Eca109細胞增殖。

表4 SIM對食管癌Eca109細胞上清中TNF-α和IL-6水平的影響Table 4.The effects of SIM on TNF-α and IL-6 levels in culture supernatant of esophageal carcinoma Eca109 cells（Mean±SD.n=6）

NF-κB p65是NF-κB通路中重要轉錄子，可與基因啟動子或增強子特異性結合啟動轉錄。NF-κB家族包括RelA（p65）、c-Rel、RelB、NF-κB1（p50/p105）和NF-κB2（p52/p100）共5種蛋白，多數情況下p65與p50組成同源或異源二聚體，調控細胞增殖、分化、凋亡、遷移及侵襲過程［13-15］。IκB家族包含IκBα、IκBβ、IκBε、NF-κB前體蛋白及核IκB蛋白，是NF-κB通路的抑制蛋白家族，非激活狀態下，NF-κB p65可與IκB蛋白結合停留在胞漿不發揮轉錄活性，NF-κB p65蛋白由胞漿向核轉移是NF-κB信號通路激活的關鍵點［16-17］。任麗平等［18］研究報道，槐定堿可通過上調IκB-α蛋白，下調NF-κB p65蛋白及其下游炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，抑制胰腺癌capan-1細胞增殖，促進其凋亡。本研究結果顯示，與NC組比較，SIM可促進IκB-α蛋白表達，抑制NF-κB p65蛋白表達，提示SIM可能通過上調IκB-α抑制NF-κB p65通路激活從而抑制食管癌Eca109細胞增殖。Shalkami等［19］研究報道，順鉑可顯著增加大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6水平，培哚普利治療后可上調大鼠腎組織caspase-3蛋白表達，下調Bcl-2、TNF-α、IL-6表達，可減輕順鉑誘導的大鼠腎毒性作用。Kim等［20］研究報道，SIM聯合貝加莫汀通過調節NF-κB信號通路，下調介導細胞增殖（cyclin D1）、細胞存活（cIAP-1、Bcl-2、Bcl-xL和survivin）、侵襲（MMP-9）和血管生成（VEGF）相關蛋白的表達，引起TNF誘導的慢性粒細胞白血病細胞S期阻滯，促進其凋亡，且與對照組比較，SIM聯合貝加莫汀可抑制TNF-α誘導的NF-κB活化、IκB-α降解和p65向細胞核移位。本研究結果發現，與NC組比較，SIM可降低食管癌Eca109細胞上清液中TNF-α、IL-6水平及胞核p65蛋白表達，p65核移位可刺激炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-2和IL-1β等產生及分泌，炎性因子又可激活NF-κB表達，形成正反饋環路，提示SIM可能通過降低TNF-α和IL-6水平負反饋調節NF-κB p65通路，抑制p65核移位，減輕炎癥反應，抑制食管癌Eca109細胞增殖。

綜上所述，辛伐他汀可抑制食管癌Eca109細胞增殖，其機制可能與上調 IκB-α，下調 cyclin D1、c-Myc、抑制p65核移位及NF-κB p65通路下游炎癥因子TNF-α和IL-6表達有關。