子宮內膜異位癥中錯配修復基因1啟動子區異常甲基化與甲基化轉移酶的關系*

單莉莉，何可人，溫佳琦，王中海

子宮內膜異位癥中錯配修復基因1啟動子區異常甲基化與甲基化轉移酶的關系*

單莉莉1，何可人1，溫佳琦1，王中海2*

（1. 深圳職業技術學院 醫學與護理學院，廣東 深圳 518055；2. 華中科技大學 協和深圳醫院，廣東 深圳 510000）

為探討錯配修復基因1（human mutL homolog 1，hMLH1）啟動子區異常甲基化與甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的關系，揭示子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）的可能病因，留取43例卵巢子宮內膜異位癥患者的異位內膜組織納入EM組，留取30例其他婦科手術患者的正常子宮內膜納入對照組．采用甲基特異性PCR（methylation specificity PCR，MSP）檢測2組標本中hMLH1啟動子區甲基化水平．同時采用免疫組化SP法，檢測2組標本中DNMT1和DNMT3a、DNMT 3b的表達．結果顯示，EM組甲基化率37%（16/43），對照組甲基化率3%（1/30），兩者比較，差異有統計學意義（＜0.05）．EM組DNMT1表達陽性率為28%（12/43），對照組DNMT1表達陽性率為3%（1/30），兩組比較，差異有統計學意義（＜0.05）．甲基化的EM標本中，DNMT1表達陽性率為69%（11/16）；未甲基化的EM標本中，DNMT1表達陽性率為4%（1/27），兩組比較，差異有統計學意義（＜0.05）．DNMT1高表達所致的hMLH1啟動子區異常甲基化可能是子宮內膜異位癥的病因之一．

子宮內膜異位癥；hMLH1；甲基化；甲基化轉移酶

子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）在育齡期女性中的發病率逐年升高，易造成不孕，影響女性生活質量[1]．內異癥病因目前尚不清楚，已有研究證實：hMLH1啟動子區異常甲基化是內異癥的可能病因，與國內外很多學者的研究結果一致[2]．甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）是DNA甲基化的關鍵酶，與DNA甲基化活性有密切關系．本項研究提取內異癥組織中的DNA，用甲基特異性PCR（methylation specificity PCR，MSP）檢測組織中錯配修復基因1（human mutL homolog 1，hMLH1）啟動子區甲基化水平；采用免疫組化SP法，檢測內異癥組織中DNMT1和DNMT3a、DNMT3b的表達，同時用正常子宮內膜組織做對照，探討內異癥中hMLH1啟動子區異常甲基化與DNMT的關系，揭示內異癥的可能病因．

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

選擇2018年6月至2019年1月華中科技大學協和深圳醫院收治的卵巢子宮內膜異位癥病人43例，年齡為26~45歲，無其他并發疾病，留存卵巢的異位內膜組織．同期，在該院行其他婦科手術（主要為子宮脫垂手術或節育術）的病人30例，年齡29~38歲，無其他并發疾病，留存正常子宮內膜組織．

1.2 方法

1）采用小量組織基因組DNA抽提試劑盒提取組織DNA，設計并合成了hMLH1甲基化引物（hMLH1-m）和非甲基化引物（hMLH1-u），采用MSP檢測組織中hMLH1啟動子區的甲基化狀態，瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外凝膠成像系統下觀察．

2）采用免疫組化SP法檢測組織中DNMT1、DNMT3a、DNMT 3b的表達，DNMT陽性出現在子宮內膜腺上皮的胞漿中，呈黃棕色沉淀．隨機選擇5個高倍鏡視野（×400），觀察黃棕色沉淀所占比例，取5個高倍鏡視野平均值，≥10%為陽性，＜10%為陰性．

1.3 統計學分析方法

本研究數據采用SPSS21.0統計學軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05示差異有顯著意義．

2 結 果

2.1 hMLH1啟動子區甲基化情況

43例內異癥組織中，16例出現甲基化（m），27例出現未甲基化（u），甲基化率37%．30例正常子宮內膜組織中，1例出現甲基化，甲基化率3%．見表1，圖1-3．兩者比較，差異有統計學意義（＜0.05）

表1 hMLH1啟動子區甲基化情況

圖1 對照組DNA hMLH1啟動子區甲基化

1、2、3、9、10、11號部分甲基化；4、5、6、12、13、14、15、16、19、20號完全甲基化，7、8、17、18、21-43號未甲基化

18號部分甲基化，其余全部未甲基化

2.2 DNMT1、DNMT3a、DNMT 3b的表達

內異癥組與正常子宮內膜組均未檢測到DNMT3b的表達．內異癥組中，DNMT3a表達陽性2例，表達陽性率為5%（2/43例），正常子宮內膜組中，DNMT3a表達陽性1例，表達陽性率為3%（1/30例），兩組比較，差異無統計學意義（＞0.05）．內異癥組中，DNMT1表達陽性12例，表達陽性率為28%（12/43例），正常子宮內膜組中，1例DNMT1表達陽性，表達陽性率為3%（1/30例），兩組比較，差異有統計學意義（＜0.05）（表2、圖4、圖5）．

2.3 內異癥中DNMT1、DNMT3a的表達

16例hMLH1啟動子區異常甲基化的內異癥中，11例DNMT1表達陽性，表達陽性率為69%；27例hMLH1啟動子區未甲基化的內異癥中，1例DNMT1表達陽性，表達陽性率為4%，兩組比較，差異有統計學意義（＜0.05）．16例hMLH1啟動子區異常甲基化的內異癥標本中，1例DNMT3a表達陽性，表達陽性率為6%；27例hMLH1啟動子區未甲基化的內異癥標本中，1例DNMT3a表達陽性，表達陽性率為4%，兩組比較，差異無統計學意義（＞0.05）．其中，1例異常甲基化標本DNMT1、DNMT3a同時表達陽性（見表3）．

表2 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在內異癥及正常內膜中的表達

圖4 DNMT1在內異癥組織中表達陽性（SP×400）

圖5 DNMT1在正常內膜組織中表達陰性（SP×400）

表3 DNMT1、DNMT3a在內異癥中的表達

3 討 論

人類基因組錯配修復反應可修復DNA復制中出現的堿基錯配、消除不配對序列，從而防止DNA復制差錯的發生．錯配修復基因（mismatch repair gene，MMR）與錯配修復反應有密切關系，hMLH1是MMR中最重要的成員，國內外很多研究已證明，hMLH1啟動子區異常甲基化導致的hMLH1表達缺陷，在結腸癌、子宮內膜癌、直腸癌、胃癌等的發生過程中起重要作用[3-5]．內異癥屬于婦科良性疾病，卻具有浸潤、轉移、復發等惡性腫瘤的特點，已有研究證實：hMLH1啟動子區異常甲基化導致的hMLH1表達缺陷可能是內異癥的病因之一[6]．本次研究結果進一步支持了上述論斷，內異癥組織與正常子宮內膜組織比較，hMLH1啟動子區異常甲基化的發生率更高．

DNA甲基化需要DNMT的催化，已有研究證明，主要有3種DNMT參與DNA甲基化過程．DNMT3a、DNMT3b的主要功能是參與DNA從頭甲基化，對未甲基化DNA的親和力及生物活性更高，DNMT3a、DNMT3b將未甲基化的位點進行甲基化，建立新甲基化．DNMT1的主要功能是參與DNA甲基化狀態的維持，對于半甲基化DNA的親和力及生物活性更強，催化復制后DNA子鏈的甲基化，使其保持與親鏈相同的甲基化狀態．本研究提示，內異癥組織中存在DNMT1的高表達，hMLH1啟動子區異常甲基化與DNMT1的高表達密切相關，與DNMT3a、DNMT3b無關．這一研究結果提示：DNMT1高表達所致的hMLH1啟動子區異常甲基化可能是子宮內膜異位癥的病因之一．

研究表明，甲基化轉移酶的過度表達可以作為DNA甲基化的重要指標．很多內異癥病人沒有臨床癥狀，能否通過DNMT1表達的監測，協助內異癥診斷；內異癥治療后的復發問題，一直困擾著婦科醫生，能否通過監測DNMT1的表達，預警內異癥復發，可作為我們未來的研究方向．已有學者在動物實驗中證明：采用甲基轉移酶抑制劑，抑制甲基轉移過程，進行基因靶向治療，對疾病的治療有重要作用[7，8]．2006年在美國上市的DNA甲基轉移酶抑制劑—地西他濱（Decitabine，DacogenTM）和阿扎胞苷（Azacitidine，VidazaTM）已用于治療骨髓異常增生綜合征（myelodysplasia syndrome，MDS），該藥物可通過抑制基因異常甲基化而在基因水平治療MDS．目前學界認為，EM是一種表觀遺傳學疾病，而表觀遺傳修飾是一種可逆性的修飾，未來，能否在臨床應用DNA甲基轉移酶抑制劑，通過抑制基因異常甲基化而治療內異癥，尚待進一步研究．

[1] 謝幸，孔北華，段濤，等．婦產科學[M]．北京：人民衛生出版社，2018．

[2] Saare M, Krigul K L, Laisk-Podar T, et al. DNA methylation alterations-potential cause of endometriosis pathogenesis or a reflection of tissue heterogeneity[J]., 2018，99（2）：273-282．

[3] Westwood A, Glover A, Hutchins G, et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation[J]., 2019，72（6）：443-447．

[4] Qi M, Xiong X. Promoter hypermethylation of RARβ2, DAPK, hMLH1, p14, and p15 is associated with progression of breast cancer: A PRISMA-compliant meta-analysis[J].(), 2018，97（51）：e13666．

[5] Cornel K M C, Wouters K, Van de Vijver K K, et al. Gene Promoter Methylation in Endometrial Carcino- genesis[J]., 2019，25（2）：659-667．

[6] Fuseya C, Horiuchi A, Hayashi A, et al. Involvement of pelvic inflammation-related mismatch repair abnormalities and microsatellite instability in the malignant transformation of ovarian endometriosis[J]., 2012，43（11）：1964-72．

[7] Vet? B, Szabó P, Bacquet C, et al. Inhibition of DNA methyltransferase leads to increased genomic 5-hydroxymethylcytosine levels in hematopoietic cells[J]., 2018，8（4）：584-592．

[8] 張婷，夏良斌，高靜，等．DNA甲基轉移酶抑制劑對子宮內膜異位灶的影響[J]．實用婦產科雜志，2016，32（1）：57-62．

The Relationship between the DNA Methyltransterase and the Methylation of Human MutL Lomolog 1 Promoter in Endomrtriosis

SHAN Lili1, WEN Jiaqi1, WANG Zhonghai2

（）

This paper is to study the relationship between the methylation of human mutL homolog 1(hMLH1) promoter and the DNA methyltransterase (DNMT), and the relationship between DNMT and endometriosis(EM). Methylation of hMLH1 promoter was verified by methylation specificity PCR(MSP) and the protein expression of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b was analysed by the immunohistochemistry SP method in 43 tissues of endometriosis and 30 tissues of normal endometrium. Results show that there was significant difference between two groups(＜0.05). First, the hMLH1 promoter methylation in endomrtriosis was 37%(16/43), while in control group was 3%(1/30). Second, the protein expression of DNMT1 in endomrtriosis was 28%(12/43), while in control group was 3%(1/30).Third, the protein expression of DNMT1 in endomrtriosis with methylation of hMLH1 promoter was 69%(11/16), while the protein expression of DNMT1 in endomrtriosis without methylation of hMLH1 promoter was 4%(1/27). The high expression of DNMT1 with high methylation of hMLH1 promoter may be one of the mechanisms of endometriosis.

endomrtriosis; triosishuman mutL homolog 1(hMLH1); methylation; methyltransferase inhibitou

2020-05-25

深圳職業技術學院校級自然科學類重點資助項目（601822K31007）

單莉莉，女，吉林人，醫學博士，副教授，副主任醫師，主要研究方向：子宮內膜異位癥發病機制．

王中海，男，安徽人，醫學學士，主任醫師，碩士生導師，主要研究方向：子宮內膜異位癥發病機制的研究、婦科微創手術技術．

R711.71

A

1672-0318（2020）05-0047-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2020.05.009