王不留行黃酮苷對ox-LDL誘導的巨噬細胞活性氧及泡沫化的影響

徐 非，馬欣雨，龔蕾蕾，劉藝筱，程蕊棠，朱雨薇，繆孫涵，邱麗穎

(江南大學無錫醫學院，江蘇 無錫 214122)

動脈粥樣硬化是一種常見的動脈血管疾病，特點是脂肪和纖維堆積使動脈彈性降低、管腔變窄[1]。隨著人們生活水平的提高，動脈粥樣硬化發病率逐年上升，并趨于年輕化。因此，探索干預動脈粥樣硬化的新型藥物，從而改善動脈粥樣硬化的治療效果，是迫切需要突破的科學問題。

動脈粥樣硬化是一種受多因素影響的炎癥反應和脂類平衡紊亂性疾病。目前認為氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL)是引起動脈粥樣硬化的始動及核心要素。ox-LDL是一種氧化應激損傷蛋白，不經常規LDL受體途徑代謝，而是由清道夫受體(CD36)和ox-LDL受體(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX1)識別并內吞進入細胞，引起胞內脂質沉積和泡沫樣改變[2]。動脈粥樣硬化最早的病變過程是單核細胞趨化至血管內皮下的間隙，分化為巨噬細胞。巨噬細胞隨后可使侵入到內膜下的脂蛋白發生氧化，產生ox-LDL，使其喪失與LDL受體結合的能力。ox-LDL可與巨噬細胞表面的清道夫受體結合。清道夫受體與LDL受體不同，不受胞內膽固醇水平高低的限制，使得脂質在巨噬細胞內大量積聚，并逐步轉變為富含大量膽固醇的泡沫樣細胞[3]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是氧化應激過程的主要參與者。ROS是心血管疾病中重要的危險因子之一，參與了包括細胞炎癥在內的病理過程。p38/MAPK信號通路能夠被不良刺激如ROS，激活并介導發生炎癥反應[4],進而參與胞內脂質沉積過程。

王不留行是石竹科植物麥藍菜[vaccariasegetalis(Neck.) Garcke]的種子，王不留行黃酮苷(vaccarin)是從王不留行中分離純化的天然有活性的黃酮苷[5]。本課題組近年來的研究發現，vaccarin可通過抑制Notch信號通路從而保護內皮細胞免受高糖損傷[6-7]。vaccarin還可激活FGF2/FGFR-1信號通路誘導新生血管的形成[8]，促進內皮細胞增殖、遷移[6]。現有的證據表明vaccarin在維護心血管功能中的重要作用。然而，有關vaccarin對動脈粥樣硬化的形成以及過程中導致的巨噬細胞胞內脂質沉積的作用尚不清楚，有待進一步研究。

另外，本課題組前期研究表明， vaccarin可有效抑制內皮細胞內ROS水平[9-10]，但vaccarin對ox-LDL誘導的巨噬細胞內ROS水平以及胞內脂質沉積的影響目前尚不清楚。本實驗主要研究在ox-LDL誘導巨噬細胞脂質沉積過程中，vaccarin對胞內ROS產生，p38/MAPK信號通路的活化及脂質沉積的影響。為今后動脈粥樣硬化的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑DMEM培養基(HyClone，美國，AE29170268)；ox-LDL(上海索萊寶科技有限公司，20190806)；油紅O染料(上海索萊寶科技有限公司，1219D051)；DCFH-DA探針試劑盒(上海索萊寶科技有限公司，803A021)；vaccarin(上海士峰生物科技有限公司，19042671)；H2O2(Sigma，美國，323381)；N-乙酰半胱氨酸(NAC)(Sigma，美國，1724426)；SB203580(SB)(Merck，德國，559389)；anisomycin(ani)(Cell Signaling Technology，美國，931398-72-0)、p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)抗體(Cell Signaling Technology，美國，4511)；甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒(南京建成生物有限公司，20171216)；膽固醇酯(cholesteryl ester,CE)試劑盒(Abcam，英國，ab65359)；p38MAPK抗體(Abcam，英國，ab31828)；β-actin抗體(Abcam，英國，ab179467)；辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔及鼠抗體(江蘇康為世紀生物科技有限公司，01334/10426及01325/20348)。

1.2 實驗儀器CO2細胞恒溫培養箱(Thermo，美國)；HS-840-U型超凈工作臺(常熟市雪科電器有限公司)；低速離心機(上海醫療器械廠)；電泳儀、濕轉儀、全能型凝膠成像分析系統(Bio-Rad，美國)；蔡司全自動正置熒光顯微鏡(Zeiss，德國)；酶標儀(BioTek，美國)。

1.3 細胞培養將Raw 264.7細胞接種于含有10% FBS，1%青鏈霉素的DMEM培養基中，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行后續處理。

1.4 實驗方法

1.4.1油紅O染色法檢測巨噬細胞內脂質沉積情況 取生長狀態良好的Raw 264.7細胞，消化處理后，以1×104個/孔接種于96孔板中。按照細胞油紅O染色方法[11]進行處理，顯微鏡下拍照觀察。

1.4.2細胞內ROS水平檢測 DCFH-DA探針能夠用于檢測細胞內的ROS水平。在處理好的Raw 264.7細胞中加入10 μmol·L-1的DCFH-DA。 37 ℃避光孵育 30 min，用PBS清洗3遍，使用熒光顯微鏡拍照檢測熒光強度。

1.4.3細胞內TG和CE水平檢測 取生長狀態良好的Raw264.7細胞，消化，計數后，以20×105個/孔均勻接種于6孔板中。按照不同的分組加入相應的試劑進行處理。24 h后，再按照試劑盒的說明書處理細胞，使用酶標儀分別在510 nm和570 nm下檢測OD值，并進行分析。

1.4.4免疫印跡(Western blot)檢測p38蛋白及其磷酸化表達水平 RIPA緩沖液裂解細胞后，提取細胞總蛋白，定量變性后，進行SDS-PAGE電泳，隨后轉移到PVDF膜上。轉膜結束后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，p38MAPK、p-p38MAPK(Thr180/Tyr182)、β-actin抗體按說明書稀釋，4 ℃孵育過夜。用1×TBST充分清洗后，使用HRP標記的二抗室溫孵育2 h。用1×TBST清洗后進行顯影，最后使用ImageJ分析目標蛋白灰度值。

2 結果

2.1 vaccarin改善ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質沉積通過油紅O染色發現，Raw 246.7細胞經100 mg·L-1ox-LDL處理24h后，與對照組相比出現明顯脂質沉積(Fig 1A)。另外，TG以及CE測定結果顯示，ox-LDL處理組脂質含量明顯升高(Fig 1B)。實驗中發現vaccarin能夠改善胞內脂質沉積，通過不同濃度的vaccarin(1、2、5、10 μmol·L-1)與ox-LDL共同處理細胞，發現與ox-LDL組相比，在vaccarin為5 μmol·L-1時能夠明顯降低TG和CE水平，改善胞內脂質沉積(Fig 1A，B)，故選取5 μmol·L-1vaccarin進行后續實驗。

Fig 1 Effect of vaccarin on lipid deposition in Raw 264.7 induced by A.Oil red O staining of different groups; B.TG、CE levels.*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ox-LDL.

2.2 vaccarin抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞ROS產生及p38/MAPK信號通路活化實驗通過測定ROS水平，發現與對照組相比，ox-LDL組ROS產生增加，而vaccarin能夠逆轉這一效果(Fig 2A)。另外，Western blot結果發現，ox-LDL組p38蛋白磷酸化水平增加，而vaccarin能夠使其表達降低(Fig 2B)。推測vaccarin能夠抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞ROS產生及 p38/MAPK信號通路活化。

Fig 2 Effect of vaccarin on ROS production and p38/MAPK in Raw 264.7 induced by A.Intracellular levels of ROS in different groups; B.Expression of protein p38 and p-p38. 1:Control; 2:ox-LDL;3:ox-LDL+Vaccarin;4:Vaccarin；*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ox-LDL.

2.3 vaccarin通過ROS/p38信號通路抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質沉積油紅O染色以及CE檢測發現，預孵ROS抑制劑NAC和p38/MAPK抑制劑SB后能夠增強vaccarin對ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質沉積的清除作用(Fig 3A，C ；Fig 3D，F)。而預孵ROS激活劑H2O2和p38/MAPK激活劑ani能夠一定程度逆轉這一效果(Fig 3B，C；Fig 3E，F)。綜上，推測vaccarin可能通過ROS/p38信號通路抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質沉積。

Fig 3 Effect of vaccarin on lipid deposition in Raw 264.7 induced by ox-LDL through ROS/p38 signaling pathways A.Oil red O staining of different groups pre-incubated with NAC; B.Oil red O staining of different groups pre-incubated with H2O2; C.CE levels of different groups pre-incubated with NAC and H2O2; D.Oil red O staining of differentgroups pre-incubated with SB; E.Oil red O staining of different groups pre-incubated with ani; F.CE levels of different groups pre-incubated with SB and ani.*P<0.05 vs ox-LDL,#P<0.05 vs ox-LDL+Vaccarin.

2.4 p38/MAPK信號通路在 vaccarin抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質沉積中起決定作用Western blot結果顯示，預孵ROS抑制劑NAC和p38/MAPK抑制劑SB后能夠降低ox-LDL誘導的p38蛋白磷酸化水平，同時能夠協同增強vaccarin降低p38 蛋白磷酸化水平的程度(Fig 4A，C)。另外，預孵ROS激活劑H2O2和p38/MAPK激活劑ani后能夠明顯增加ox-LDL誘導的p38蛋白磷酸化水平，并且逆轉vaccarin對p38蛋白磷酸化的抑制效果(Fig 4B，D)。繼而表明，p38/MAPK信號通路或許在vaccarin抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質沉積中起決定作用，即ox-LDL可以通過增加ROS的產生進而激活p38/MAPK信號通路從而導致巨噬細胞脂質沉積，而vaccarin可以改善這一效果。

Fig 4 Expression of protein p38 and p-p38 in Raw 264.7 A.Western blot analysis of groups incubated by NAC; B.Western blot analysis of groups incubated by H2O2; C.Western blot analysis of groups incubated by SB; D.Western blot analysis of groups incubated by ani.*P<0.05 vs ox-LDL,#P<0.05 vs ox-LDL+Vaccarin.

3 討論

心血管系統疾病病死率目前居世界首位，遠高于惡性腫瘤。動脈粥樣硬化為心血管疾病發展進程中的特征性病理改變，機制非常復雜。LDL在動脈粥樣硬化病程進展的各階段均扮演重要角色[12]。起初LDL在動脈壁處聚集，受到氧化修飾后，生成ox-LDL可募集循環血液中的單核細胞，進入動脈中膜層分化成巨噬細胞[13]。動脈粥樣硬化與炎癥反應密切相關，其特征是動脈中脂質和纖維性物質積累。早期病變過程包括：巨噬細胞通過清道夫受體CD36等吞噬LDL以后，將其修飾為LDL-C為主的膽固醇，并且積聚成為“泡沫細胞”。本研究結果表明，ox-LDL可誘導巨噬細胞產生明顯的脂質沉積，表現為細胞內甘油三酯和膽固醇酯水平均顯著升高。

正常生理狀態，胞內維持著氧化與抗氧化的平衡。當細胞遭遇如ox-LDL等病理因素的刺激時，胞內平衡被破壞，產生大量ROS，后續表現為多種細胞毒效應的產生[14]。本研究結果顯示，ox-LDL使巨噬細胞內ROS 水平顯著升高。表明ox-LDL暴露，使巨噬細胞的抗氧化能力受損，氧化應激加劇。既往研究顯示，p38/MAPK信號通路的激活，致使胞內炎性相關細胞因子水平升高，進而使胞內ROS水平升高[14]。本研究中，ROS抑制劑NAC在抑制巨噬細胞胞內ROS產生后，我們觀察到脂質沉積的現象有所改善，這種改善可被vaccarin進一步加強。同時ROS激活劑H2O2處理細胞后，脂質沉積情況顯著加重，且這種現象可被vaccarin逆轉。以上研究結果表明，oxLDL可誘導巨噬細胞內ROS水平增加，且ROS可導致胞內脂質沉積現象的發生，而vaccarin可改善ox-LDL誘導的脂質沉積。

為了進一步研究p38/MAPK信號通路的作用，本研究使用p38/MAPK特異性抑制劑SB203580，抑制通路活性。結果表明，p38/MAPK通路抑制后，可降低巨噬細胞胞內脂質沉積現象，且這種抑制作用被vaccarin進一步加強。反之，p38/MAPK特異性激活劑anisomycin能夠加重胞內脂質沉積現象，而能夠被vaccarin反轉。另外，研究中發現，使用ROS抑制劑NAC后能夠抑制p38/MAPK信號通路活性，而ROS激活劑H2O2則相反。表明ROS是p38/MAPK信號通路激活的始動因子，干預ROS水平或p38/MAPK信號通路活性，均可引起胞內脂質沉積現象的改變，而在此過程中，vaccarin起正向調節作用。

根據以上結果，可得出以下結論：ox-LDL能夠誘導巨噬細胞內發生氧化應激，產生ROS。ROS能夠誘導p38/MAPK信號通路激活，進而誘發巨噬細胞胞內脂質沉積的發生，而vaccarin可通過調節ROS水平和p38/MAPK信號通路活化程度，改善ox-LDL誘導的胞內脂質沉積現象。vaccarin對于ox-LDL誘導的巨噬細胞胞內脂質沉積的改善作用，為今后干預治療提供了新的思路。