基于網絡藥理學的二仙湯治療抑郁癥的作用機制研究

羅武龍，陳 潔，牛 婕，李 玲，曾寧溪，嚴 燦，吳麗麗

(廣州中醫藥大學中西醫結合基礎研究中心,廣東 廣州 510006)

抑郁癥是一種情感障礙疾病，可以由多種因素引起，高發病率和高致殘率是其特點。在抑郁癥的藥物治療中，存在治愈率低、復發率高等突出問題。二仙湯是中醫經典名方，方中仙茅、仙靈脾可以溫腎陽，補腎精；黃柏、知母滋腎陰，瀉腎火；當歸溫潤養血，調理沖任。已有研究證實，二仙湯及其加減對抑郁癥具有明顯的改善作用[1-2]。

網絡藥理學是一種以系統生物學和多向藥理學為理論基礎，通過網絡數據庫檢索及計算機虛擬計算，構建“藥物-成分-靶點-疾病”間網絡，用于探討藥物對疾病作用機制的生物信息學新研究方法[3]。中醫學理論體系的基本特點為整體觀和辨證論治，與網絡藥理學的系統性、整體性有異曲同工之妙。網絡藥理學能有效推動中藥復方的深入研究，揭示中藥藥效物質基礎及分子機制。分子對接是基于受體和配體的空間結構的對接，能快速預測中藥成分與靶點之間的結合力。本研究采用網絡藥理學與分子對接相結合的方法，探討二仙湯抗抑郁的可能作用機制。

1 材料與方法

研究流程見Fig 1。

Fig 1 Research process of depression resistance of Erxian decoction

1.1 二仙湯中化學成分的獲取在中藥藥理學數據庫及分析系統平臺中搜索，結合文獻檢索，篩選二仙湯中仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母的所有化學成分。

1.2 口服生物利用度和類藥性篩選中藥多為口服制劑，到達靶標器官、組織發揮作用，需要經過吸收、分布、代謝、排泄，即ADME過程。通過TCMSP數據庫以閾值OB≥30%，DL≥0.18(中藥ADME的核心參數是口服生物利用度，OB；類藥性，DL)篩選出符合條件的活性成分。當歸中一些具有高含量和高生物活性，但不全部滿足這兩個標準的化合物，因文獻報道其具有顯著的藥理學作用，故也將其作為當歸的活性成分予以保存[4]。

1.3 二仙湯潛在靶點挖掘基于TCMSP數據庫，將仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母中的活性成分與潛在靶點逐個配對，通過UniProt數據庫中的UniProtKB功能，限定物種為“human”，輸入蛋白名稱，得到靶點蛋白的官方名稱(official gene symbol)，即為二仙湯活性成分的潛在作用靶點。

1.4 抑郁癥相關靶點獲取在基因疾病關聯數據庫DisGeNET(http://www.disgenet.org/home/)以關鍵詞“mental depression”進行檢索，得到抑郁癥的治療靶點。

1.5 二仙湯與抑郁癥PPI網絡構建String數據庫(https://string-db.org/)可以預測蛋白質相互作用信息。利用獲得的預測信息，將二仙湯靶點映射到抑郁癥已知的治療靶點的靶點上，構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡(PPI)，并利用可視化軟件Cytoscape 3.6.0的“Network Analyzer”插件以節點度值(Degree)、中心性(Closeness Centrality)為拓撲指標對網絡進行拓撲分析，網絡中節點(node)之間若存在調控作用關系則以邊(edge)相連。Degree和Closeness Centrality常用于說明網絡節點的重要性，其值越大，說明該節點在網絡中越重要，對該網絡起主要調控作用的核心靶點以大于Degree中位數的2倍和大于Closeness Centrality中位數作為拓撲指標進行拓撲分析篩選。

1.6 GO生物學過程和KEGG信號通路分析利用DAVID(http://david.nifcrf.gov/)數據庫對拓撲分析后的核心靶點進行GO生物學過程分析和KEGG通路分析，首先以P值作為篩選指標，選取P<0.01的條目，結合文獻閱讀篩選與抑郁癥密切相關的通路，得到核心靶點參與的關鍵通路信息，將二仙湯對應的靶蛋白直接映射到通路上，選取既包含藥物靶點又包含疾病靶點的通路。

1.7 “活性成分-靶點-通路”網絡的構建為了更清晰的展現復方成分、核心靶點與通路之前的關系，將通路上所含有的活性成分及靶點，利用Cytoscape3.6.0軟件構建二仙湯活性成分-靶點-通路圖。在該網絡中，活性成分、核心靶點或通路以節點表示；活性成分、靶點及作用通路之間的關系以邊表示。

1.8 分子對接驗證分子對接可以調整受體化合物的的位置、構像等，將三維結構已知的分子依次放于靶標分子的活性位點處，尋找小分子化合物與靶蛋白的最佳結合體。其結果可顯示中藥活性成分與重要靶蛋白之間的結合活性, 對網絡藥理的分析結果起到一定的驗證作用。

利用Uniport檢索靶點，選擇高分辨率的PDBID，化合物的3D結構文件可在PubChem中下載，運用SystemsDock進行分子對接驗證。PTGS2是“活性成分-靶點-通路”網絡中Degree值最大的靶點，將其與對應的部分活性成分及通路中二仙湯和抑郁癥共有靶點中Degree排名最靠前的兩個靶點AKT1和MAPK1與各自對應的部分活性成分進行分子對接驗證。

2 結果

2.1 二仙湯中活性成分及潛在靶點篩選通過TCMSP數據庫檢索，二仙湯中仙靈脾得到化學成分130種，仙茅78種，巴戟天174種，當歸135種，黃柏140種，知母81種；根據口服生物利用度和類藥性分析并結合文獻報道，二仙湯共篩選出77個主要活性成分，其中仙靈脾23種、仙茅7種、巴戟天18種、當歸16種、黃柏37種、知母15種。值得注意的是，谷甾醇(stigmasterol)是黃柏、知母、仙茅、當歸的共有活性成分，β-谷甾醇(beta-sitosterol)是巴戟天、仙茅、當歸的共有活性成分，槲皮素(quercetin)是黃柏和仙靈脾的共有活性成分，山柰酚(kaempferol)是仙靈脾和知母的共有活性成分。將篩選得到的活性成分基于TCMSP逐一配對潛在靶點，得到二仙湯的潛在靶點。其中黃柏有225個靶點，當歸有94個靶點，巴戟天有60個靶點，仙靈脾有256個靶點，仙茅有55個靶點，知母有118個靶點，重復靶點僅保留1個，二仙湯共有268個潛在靶點。

2.2 精神抑郁的治療靶點獲取在DisGeNET數據庫中共檢索獲得574個精神抑郁的已知治療靶點。

2.3 靶蛋白PPI網絡分析基于String數據庫得到二仙湯268靶點和精神抑郁574靶點的蛋白互作(PPI)網絡，共有713個節點和17 043條蛋白互作關系。將該PPI網絡中Degree中位值的兩倍即70，Closeness Centrality的中位數即0.499作為拓撲指標篩選，最后得到90個靶點，作為二仙湯發揮抗抑郁作用的核心靶點。這90個靶點包括52個來源于二仙湯的靶點，68個來源于精神抑郁的已知治療靶點，以及30個共同來源的靶點。

2.4 GO生物過程和KEGG代謝通路富集分析將拓撲分析得到的90個靶點映射到GO生物學過程和KEGG通路上，GO生物學過程共得到644條，以P<0.01為篩選指標，選區與抑郁癥相關的條目，共53條，主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調控、ERK1的正調控、調節血壓、凋亡調控等，見Fig 2。KEGG共篩選得到127條通路，首先，以P<0.01為篩選指標，得到通路106條；其次，結合已知抑郁癥病理機制及文獻報道，選出與抑郁癥密切相關的24條通路。在這24條通路中，包括與凋亡相關的7條通路:Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路等；與突觸可塑性相關的8條通路：多巴胺能神經突觸、ERBB信號通路等；3條與神經發生相關的通路:cAMP信號通路和VEGF信號通路;6條與炎癥免疫相關的通路:腫瘤壞死因子信號通路和細胞因子受體相互作用信號通路等, 見Tab 1。

Tab 1 KEGG pathway analysis of potential targets of Erxian decoction in treatment of depression

Fig 2 GO biological process analysis of potential targets of Erxian decoction in treatment of depression(only top 20 are displayed)

2.5 “成分-靶點-通路”網絡分析“活性成分-靶點-通路”網絡圖共由61個活性成分(其中八個活性成分名稱較長,用阿拉伯數字1～8代替,見Tab 2)，44個靶點，24條通路共同構建，見Fig 3。其中，二仙湯與抑郁癥的共有靶點有12個。以整個網絡的Degree中位數的兩倍即8，篩選出重要的節點。結果顯示，在這個網絡中，活性成分類的節點有四個具有高Degree值。槲皮素(quercetin，Degree=32)來自仙靈脾和黃柏；木犀草素(luteolin，Degree=22)來自仙靈脾；β-谷甾醇(beta-sitosterol，Degree=9)來自仙茅，巴戟天，當歸，黃柏；山奈酚(kaempferol，Degree=11)來自仙靈脾和知母。靶點類的節點中有15個具有高Degree值：PTGS2(Degree=56)、ADRB2(Degree=24)、MAPK1(Degree=20)、AKT1(Degree=19)、RKCA(Degree=15)、RELA(Degree=14)、NOS3(Degree=13)、MAPK14(Degree=12)、GSK3B(Degree=11)、MAPK8(Degree=10)、TNF(Degree=10)、JUN(Degree=10)、CASP3(Degree=8)、IL6(Degree=8)、OPRM1(Degree=8)。其中除PRKCA、RELA、CASP3外，其余12個靶點均是二仙湯與抑郁癥的共有靶點。通路類的節點中有13條通路具有高Degree值，其中與細胞凋亡有關的富集通路為PI3K-Akt signaling pathway(Degree=18)、MAPK signaling pathway(Degree=14)、FoxO signaling pathway(Degree=12)、Ras signaling pathway(Degree=10)、JAK-STAT signaling pathway(Degree=9)；與突觸可塑性相關的ERBB signaling pathway(Degree=9)；與神經發生相關的為Neurotrophin signaling pathway(Degree=8)、cAMP signaling pathway(Degree=8)、VEGF signaling pathway(Degree=8)；與免疫相關的TNF signaling pathway(Degree=17)、Cytokine-cytokine receptor interaction(Degree=10)、Chemokine signaling pathway(Degree=8)。

Tab 2 The “ compound-target-pathway”network replaced long compound names by Arabic numerals

Fig 3 The “ compound-target-pathway”network of Erxian decoction in treatment of depression

2.6 分子對接結果結合自由能是SystemsDock 來評價配體與受體的結合穩定性的標準，得出的分值見Tab 3。一般分值大于5.25說明分子與靶點有較好的結合活性，大于7.0說明分子與靶點的結合構型具有強烈的活性[5]。從分子對接的結果看，仙茅、當歸、黃柏、知母的共有活性成分豆甾醇(Stigmasterol)，仙茅、巴戟天、當歸的共有活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)與PTGS2的對接分數較高；二仙湯與抑郁癥的共有靶點中AKT1與對應活性成分Luteolin、MAPK1與對應活性成分Luteolin對接分數較高，說明預測的靶點與活性成分具有良好的結合能力，為后續的網路分析奠定基礎。

Tab 3 Molecular docking with high scores of potential targets and corresponding compounds in Erxian decoction

3 討論

抑郁癥發病機制復雜，二仙湯是上海中醫藥大學張伯訥教授20世紀50 年代針對圍絕經期綜合征研制出的方劑，主要用于治療更年期綜合征，也是治療抑郁癥的重要方，方中知母瀉火而滋腎保陰，并以助心火之下降，配合壯陽藥同用對陰陽俱虛于下，而又有虛火上炎的見有腎精不足和相火旺者，療效顯著，但目前對二仙湯抗抑郁癥的作用機制沒有系統研究。本文基于網絡藥理學，通過構建二仙湯“活性成分-靶點-通路”網絡，對二仙湯抗抑郁的主要活性成分、重要靶點及潛在機制進行了分析。在成分-靶點-通路網絡中篩選出4個二仙湯的重要活性成分，分別為槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。文獻報道這些活性成分與抑郁癥均有明顯聯系。其中，quercetin具有抗氧化、抗炎、降低細胞毒性、增加5-羥色胺水平等發揮抗抑郁作用[6]；luteolin可以抑制內質網應激誘導的細胞凋亡來發揮抗抑郁作用[7]；kaempferol可抑制神經元凋亡并促進神經再生[8]；抑郁小鼠在強迫游泳實驗中的不動時間可被β-sitosterol顯著縮短[9]，其機制可能是增加5-HT和NE在中樞神經系統中的含量。這提示，二仙湯可能通過這些活性成分來發揮抗抑郁效應。值得注意的是，quercetin、luteolin、kaempferol均來自二仙湯的君藥仙靈脾，這與中醫君臣佐使理論不謀而合，突出了君藥的作用。此外，beta-sitosterol來自二仙湯的仙茅、巴戟天、當歸、黃柏，quercetin來自二仙湯的仙靈脾、黃柏，kaempferol來二仙湯的自仙靈脾、知母，luteolin來自二仙湯的仙靈脾。這些重要活性成分來源于二仙湯各味中藥，多活性成分共同起效，表明二仙湯具有多中藥、多成分協同抗抑郁效應。

通過分析成分-靶點-通路網絡中Degree值篩選出15個重要的二仙湯成分靶點，其中12個是二仙湯與抑郁癥的共有靶點，這提示二仙湯可能通過這些共同靶點發揮直接的抗抑郁效應。例如，Degree值大于15的靶點PTGS2、ADRB2、ADRB1與抑郁癥密切相關。據文獻報道，PTGS2可降低神經炎癥反應來發揮抗抑郁作用[10]。ADRB2調節的差異可能是重度抑郁癥治療起效的基礎[11]。此外，這些靶點均對應了多個活性成分，如PTGS2來自beta-sitosterol等52個活性成分，ADRB2來自quercetin等22個活性成分，這說明二仙湯具有多成分、多靶點協同抗抑郁的效應。

在“活性成分-靶點-通路”網絡中，與抑郁癥相關的24條通路共篩選出13條富集通路，且這13條通路都包括在細胞凋亡、神經再生，突觸可塑性，免疫炎癥中。

神經細胞受損、凋亡是抑郁癥的一個重要病理機制。在細胞凋亡方面，包括4條富集信號通路:PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路、Fox信號通路。PI3K/Akt信號通路調控細胞生長、增殖和分化并在細胞自噬中扮演重要角色[12]，還具有保護神經細胞的作用。Akt介導Fox通路參與調控細胞凋亡及促進細胞的增殖分化，達到神經保護作用，發揮抗抑郁效應。還有研究發現，目前抗抑郁藥的療效與Ras信號通路有關[13]。Ras信號通路下游能激活MAPK等信號通路，MAPK信號通路與細胞增殖、分化、凋亡密切相關。本研究結果顯示，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分為quercetin、luteolin、kaemferol等共20個；涉及到的靶點為EGFR、IL-6、PTEN等共28個參與到這三條通路中。

突觸可塑性是大腦對應激作出的各種適應性改變，突觸可塑性異常會導致神經元反應適應性不良及異常。研究表明，慢性應激可降低海馬突觸的可塑性。與突觸可塑性相關的富集通路是ERBB信號通路。NRG1-ErbB4信號通路不僅參與調控神經系統的功能，而且對突觸可塑性的形成及神經遞質受體的表達都具有重要影響[14]。此外，在突觸可塑性中，除了ERBB信號通路這一條富集通路，還包含了5-HT、DA突觸及LTD、LTP等與抑郁癥密切相關的經典通路。長時程抑制(LTD)和長時程增強(LTP)和是突觸可塑性的兩種主要表現形式，5-HT和DA在LTD與LTD中具有關鍵作用。從我們的研究成果來看，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分為luteolin、quercetin、kaempferol等共12個；涉及到的靶點為PRKCA、AKT1、EGFR等共9個參與到這條通路中。

神經發生障礙是抑郁癥產生的關鍵病理機制。研究證實，神經發生減少的動物模型表現出類抑郁樣行為。在神經發生方面，有3種富集途徑:cAMP信號途徑、VEGF信號途徑和神經營養因子信號途徑。抑郁癥的發生發展與cAMP途徑密切相關。研究表明，抗抑郁藥物不僅可以上調受體細胞內cAMP水平，還可以增加海馬細胞內蛋白kinaseA (PKA)和CREB mRNA的表達，從而促進CREB蛋白與cAMP反應元件(cAMP response element, CRE)的結合。抑郁癥動物模型已經證明，BDNF表達水平降低和海馬神經發生的減少與抑郁樣行為同時發生，而海馬神經元損傷的修復與BDNF及相關其相關傳導通路如神經營養因子通路密切相關[15]。另外，有研究表明BDNF可能是通過調節與神經發生相關的因子如VEGF和糖皮質激素等間接性影響神經發生。從我們的研究結果來看，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分luteolin、quercetin、kaempferol等共58個；涉及到的靶點為AKT1、MAPK1、MAPK14等共16個參與到這3條通路中。

免疫炎癥反應是抑郁癥的重要發病機制之一。研究發現，抑郁癥患者存在廣泛的免疫異常。在免疫炎癥方面，包含三條富集通路：趨化因子信號通路、細胞因子受體相互作用信號通路、TNF信號通路。調節免疫應答生物活性的主要信號分子是細胞因子，文獻報道抑郁患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子的水平明顯升高，抗抑郁治療后，促炎因子恢復到正常水平[16]。趨化因子信號通路可作用于免疫炎癥[17]，阻斷單個趨化因子往往就能明顯地抑制炎癥反應。TNF信號通路與中樞神經系統的炎癥密切相關。從我們的研究結果來看，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分為luteolin、quercetin、kaempferol等共53個；涉及到的靶點為ICAM1、IL-6、TNF等共24個參與到這3條通路中。

以上分析表明，二仙湯具有多通路協同抗抑郁效應。比如，PI3K/Akt信號通路、Fox信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路可協同促進細胞凋亡。在這些途徑中存在著許多共同靶點，能夠進行信號通路對話。如AKT1，抗抑郁藥物既能磷酸化AKT1，通過PI3K/Akt的下游調控靶點mTOR及Fox來發揮改善細胞凋亡的作用，同時PI3K-Akt通過調控下游mTOR又還具有調節神經元突觸可塑性的調節，調控突觸蛋白的合成的作用。

綜上所述，二仙湯抗抑郁的活性成分包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇，山奈酚等；涉及的靶點包括PTGS2、ADRB2、MAPK1、AKT1、RKCA、RELA、NOS3、MAPK14、GSK3B、MAPK8、TNF、JUN、CASP3、IL-6、OPRM等；可通過PI3K-Akt信號通路等改善細胞凋亡、ERBB信號通路等調節突觸可塑性、神經營養因子信號通路等促進神經再生、腫瘤壞死因子信號通路等調節免疫炎癥反應發揮協同抗抑郁效應，體現了中藥復方二仙湯治療抑郁癥多成分、多靶點、多通路的作用特點。本研究的不足之處在于，對網絡藥理學的結果只采用了分子對接進行驗證。雖然分子對接可行性很強，已經逐漸深入到中藥研究的各個方面，但計算機結果不能取代實驗數據，最終還是需要生物實驗加以驗證。