利用AuNCs@GSH-CAP體系熒光增強檢測BSA的研究

程凱旋，尹建行，徐 娜*

(1.吉林化工學院 材料科學與工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

蛋白質是生命活動的基礎,許多重要的生命現象和生理活動都是通過蛋白質實現.蛋白質含量的變化與疾病息息相關,因此許多疾病相關蛋白的檢測在病理學、基因組學等方面有重要的參考價值[1].

金納米簇(AuNCs)是一種新型的熒光納米材料，其由幾個乃至上百個的金原子組成，尺寸都是在納米級別，因此它的相關性質也是介于金原子和金的大納米粒子之間的.因為金納米粒子具有獨特的尺寸效應和良好的生物相容性，以及易于制備和生物功能化修飾，且具有發光性能好持續時間長、低毒性、反應靈敏等特點，成為一種很有發展潛力的新型熒光探針[2-3].

本文首先利用谷胱甘肽(GSH)為保護劑、三水合四氯金酸氫(HAuCL4·3H2O)為還原劑，合成出金納米簇(AuNCs@GSH)，再加入CAP使金納米簇發生熒光猝滅得到(AuNCs@GSH-CAP)體系作為熒光探針，用于檢測BSA.通過實驗發現，發生熒光猝滅的金納米簇遇到BSA后，體系熒光強度有明顯的增強，并使用該方法對BSA的檢測限、線性范圍和選擇性等進行初步的討論[4-7].

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

三水合四氯金酸氫(HAuCL4·3H2O)、谷胱甘肽(GSH)和氯霉素(CAP)購買于阿拉丁試劑有限公司(中國上海)，牛血清白蛋白(BSA)，其余實驗試劑：氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、硝酸鉀(KNO3)、碳酸鈉(NaCO3)均購于天津市永大化學試劑有限公司，氨基酸(Met、Pro、Gly、Thr)均取自北京鼎國長勝生物科技有限公司(中國北京)，所有試劑均為分析純.超純水用于整個實驗過程.

觀察熒光效果用ZF-20D暗箱三用紫外分析儀，紫外波長254、365、254、365 nm，儀器功率40W(上海驥輝科學分析儀器有限公司)，熒光光譜采用F97XP熒光分光光度計測定，波長范圍：200～900 nm，波長精準度：±0.4 nm(上海棱光).紫外可見光譜用UV-2200雙單色器雙光束紫外可見分光光度計測定，波長范圍：190～1 100 nm，波長精準度：±0.25 nm(北京瑞利儀器).

1.2 實驗過程

1.2.1 AuNCs@GSH的制備

HAuCL4溶液(25 mol/L，0.4 mL)與GSH溶液(25 mol/L，0.6 mL)和4 mL超純水，在室溫下劇烈攪拌至混合物變為無色，然后在70 ℃水浴加熱條件下，繼續溫和攪拌24 h，得到金納米簇，最后將所得溶液在4 ℃條件下冷藏保存[8].

1.2.2 AuNCs@GSH-CAP體系對不同濃度的BSA的檢測

在完全相同的AuNCs@GSH溶液(2 mL)中加入相同濃度的CAP(400 μL)，混合均勻發生熒光猝滅后，分別加入不同濃度的BSA(0、1、5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L)孵育1 min之后，固定激發波長360nm處測試其熒光光譜.

1.2.3 AuNCs@GSH-CAP體系對BSA的選擇性檢測

2 結果與討論

2.1 AuNCs@GSH的表征

圖1是金納米簇的熒光發射譜和紫外譜圖，在紫外線波長為225～250 nm之間出現一個最大吸收波長243 nm，而在250～500 nm時沒有出現新的吸收峰，因此可推斷該熒光探針中沒有形成大粒徑的金顆粒.在波長為575～625 nm之間AuNCs@GSH的熒光強度出現峰值.

Wavelength/nm

2.2 AuNCs@GSH-CAP體系對BSA的檢測性能分析

由圖2(a)可以看出，AuNCs@GSH自身熒光強度較高，只加入CAP后熒光強度下降，這說明CAP使金納米簇發生熒光猝滅；在加入BSA后，熒光強度相較于只加入CAP明顯提高，這說明BSA能夠增強加入CAP后的金納米簇熒光強度.

如圖2(b)是AuNCs@GSH-CAP體系加入相同量的BSA后，隨著時間增加，0～10 min內其熒光強度的圖，在整個孵育過程中，每隔1 min取一個樣進行檢測，發現0 min時熒光強度最弱，孵育1 min后熒光強度基本達到峰值，之后的時間里熒光強度趨于穩定的，這說明體系響應時間較短，由此可以確定整個孵育時間為1 min，因此確定AuNCs@GSH-CAP體系可以對BSA進行檢測.

Wavelength/nm

在完全相同的AuNCs@GSH溶液中加入相同濃度的CAP，混合均勻發生熒光猝滅后，分別加入不同濃度的BSA(0、1、5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L)孵育1 min之后，放入熒光光度計進行分析，如圖3(a)所示，在613 nm為波長的熒光光譜中，在未加入BSA時，AuNCs@GSH因為CAP發生熒光猝滅反應，使其熒光強度較弱，隨著BSA的加入和濃度的增加，熒光強度隨之增加，由此可以得出BSA有著使AuNCs@GSH-CAP體系熒光增強的能力.

圖3(b)是AuNCs@GSH-CAP體系中加入BSA后的熒光強度差值與BSA濃度的關系圖，可以看出兩者是線性關系，其線性范圍10～160 μmol/L，線性方程F-F0=0.9536C+36.1372，R=0.974 98，其檢測限為0.1 μmol/L[9].

Wavelength/nm

2.3 AuNCs@GSH-CAP體系對BSA的選擇性

圖4 抗干擾檢測

2.4 檢測機理的研究

對AuNCs@GSH-CAP體系檢測BSA的檢測機理進行研究，如圖5所示，在加入BSA后的AuNCs@GSH-CAP體系其吸收強度明顯增強.而BSA對CAP的作用屬于靜態猝滅作用的特征，且反應是自發的吸熱反應.對于藥物等有機小分子和蛋白質等生物大分子常借助疏水作用力、氫鍵、Vander Waals力和靜電引力等相互結合形成超分子復合物，而CAP與BSA間的結合主要是氫鍵作用力和Vander Waals力，且在結合過程中產生了明顯的焓、熵負效應.因此使得AuNCs@GSH-CAP體系熒光強度增強[10].

Wavelength/nm

3 結 論

綜上所述，可以利用BSA使AuNCs@GSH-CAP體系熒光增強效果來檢測BSA，兩者在10～160 μmol/L范圍內呈線性關系，其線性方程F-F0=0.9536C+36.1372，R=0.974 98，其檢測限為0.1 μmol/L.該熒光探針制備過程簡單、易操作、條件溫、響應迅速、并且該探針相較于其他探針，具有良好的選擇性和抗干擾性，靈敏度高、檢測結果準確且熒光效果明顯.在實驗過程中取得良好的實驗效果，具有較好的發展前景.