基于生物信息學數據庫探討FOXO3基因在膀胱癌中的表達及臨床意義

陶 燕，李蘭蘭，盧建中，劉善輝，付生軍，張 靜

(蘭州大學第二醫院，甘肅省泌尿系統疾病研究重點實驗室/甘肅省泌尿系臨床醫學中心，甘肅 蘭州 730030)

膀胱癌(bladder cancer，BLCA)是全球常見的泌尿系統惡性腫瘤之一。根據美國癌癥協會的統計，在美國膀胱癌預計占所有新發癌癥病例的5%，占所有癌癥死亡人數的3%；預計2020 年膀胱癌發病率占泌尿系癌癥的第2 位；膀胱癌患者的5 年存活率僅為14%[1]。膀胱癌一般分為兩類：淺表性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌。盡管目前可用根治性膀胱切除術和新輔助化療治療膀胱癌，但由于其復發性高，預后依然比較差[2]。因此，迫切需要尋找對膀胱癌診斷和治療更有效的生物標志物。

近年來的研究發現叉頭轉錄蛋白O亞族(subfamily O of forkhead box transcription factors，FOXO)通過對轉錄過程的特異性激活參與調節細胞周期進程、能量代謝及腫瘤發生，FOXO 功能失調將導致細胞增殖失控和DNA 損傷積累，從而產生致癌作用[3]。其中FOXO3(或FOXO3a)是FOXO 亞家族中的重要成員之一，其與細胞凋亡、自噬、細胞周期、氧化應激、細胞分化、機體代謝和免疫應答等有重要關系[4]。研究表明FOXO3在多種腫瘤組織中異常表達，并與惡性腫瘤的不良預后密切相關[5-7]。本研究通過多種生物信息學數據庫挖掘FOXO3 在膀胱癌中的表達及相關信息，以探討其在膀胱癌中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 GEPIA數據收集與分析

通過GEPIA 基因表達譜動態分析數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)[8]分析 FOXO3 在膀胱癌中的表達情況。GEPIA 是基于癌癥基因組圖譜(TCGA)和GTEx項目的9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本進行數據分析。通過GEPIA數據庫也可以進行一般的生存曲線分析，包括總生存率(overall survival，OS)和無疾病生存率(disease-free survival，DFS)。此外GEPIA 還可以分析目標基因與某些免疫檢查點基因表達的相關性。

1.2 UALCAN數據庫分析

利用UALCAN 數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/)[9]分析FOXO3 在膀胱癌中的表達以及FOXO3 表達與淋巴結轉移的關系。UALCAN 是一個有效的癌癥數據在線分析和挖掘的數據庫，主要是基于TCGA 數據庫中的相關癌癥數據進行分析。

1.3 TIMER數據庫分析

通過TIMER 數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[10]中的基因模塊分析膀胱癌中FOXO3 表達與免疫細胞浸潤水平的相關性。TIMER 數據庫涵蓋了TCGA中的32種腫瘤，共計10 897個樣本。TIMER數據庫中分析的免疫細胞包括B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。

1.4 String數據庫分析

利用String數據庫探索蛋白間相互作用。String數據庫是由已知蛋白質和預測蛋白質之間相互作用的數據組成的數據庫，包括直接的相互作用和間接的相互作用。本研究通過使用String 數據庫分析FOXO3 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)，在數據庫中輸入“FOXO3”，物種類型選擇“Homo sapiens”，置信度選擇“Medium 0.400”，相互作用最大數選擇10。

1.5 統計學分析

利用GEPIA數據庫繪制生存曲線，兩組比較采用Log-rank 檢驗。通過GEPIA 數據庫基因分析工具中的Correlation 模塊，利用 Pearson、Spearman 和 Kendall 方法對給定的TCGA和GTEx表達數據進行成對基因表達相關分析。通過TIMER 數據庫中的Gene 模塊分析FOXO3基因與免疫浸潤水平的關系。以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 FOXO3基因在膀胱癌中的表達

通過GEPIA 數據庫分析了FOXO3 在膀胱癌中的mRNA表達水平。結果發現FOXO3 mRNA在膀胱癌組織中的表達明顯低于正常膀胱組織(P＜0.01，圖1)。

2.2 FOXO3基因在膀胱癌中的預后分析

通過GEPIA數據庫分析了FOXO3與膀胱癌患者的預后關系，結果顯示FOXO3 高表達組患者總生存率(OS)和無疾病生存率(DFS)較FOXO3低表達組顯著降低(OS：HR=1.4，P＜0.05；DFS：HR=1.5，P＜0.05)，見圖2，表明FOXO3 高表達與膀胱癌患者預后不良相關。

2.3 FOXO3在膀胱癌中的表達與淋巴結轉移的關系

圖1 FOXO3 mRNA在膀胱癌中的表達

通過UALCAN 數據庫分析FOXO3 mRNA 表達水平與膀胱癌淋巴結轉移的關系，結果表明FOXO3在膀胱癌無淋巴結轉移組(N0)和淋巴結轉移組(N1，N2，N3)的表達均顯著低于正常膀胱組織(P＜0.01)，見圖3。而 FOXO3 在 N0 與 N1、N2、N3 之間的表達差異無統計學意義，這說明FOXO3在膀胱癌中的表達水平與腫瘤是否發生淋巴結轉移并無顯著相關關系。

2.4 FOXO3在膀胱癌中的表達與免疫細胞浸潤的關系

通過TIMER 數據庫分析得到FOXO3 表達與膀胱癌免疫細胞浸潤的相關性結果，表明FOXO3基因表達與細胞純度無明顯相關性，與B 細胞(r=0.133，P＜0.05)、CD8+T細胞(r=0.262，P＜0.01)、CD4+T細胞(r=0.12，P＜0.05)、巨噬細胞(macrophages)(r=0.252，P＜0.01)、中性粒細胞(neutrophils)(r=0.242，P＜0.01)、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)(r=0.162，P＜0.01)的免疫浸潤水平呈顯著正相關(圖4)。這提示FOXO3 有可能參與膀胱癌細胞的免疫浸潤過程。

圖2 GEPIA數據庫分析FOXO3對膀胱癌患者總生存率和無疾病生存率的影響

圖3 FOXO3在膀胱癌中的表達與淋巴結轉移的關系

同時我們收集了常見的40 多個免疫檢查點基因，通過GEPIA 數據庫的單基因分析工具中Correlation 模塊分析了FOXO3基因表達與膀胱癌中免疫檢查點基因表達水平的關系，發現FOXO3基因與NRP1(r=0.16，P＜0.01)、 CD200R1(r=0.17，P＜0.01)、 CD276(r=0.096，P＜0.05)、CD1604(r=0.17，P＜0.05)4 個免疫檢查點基因的表達水平有顯著的正相關性(圖5)。

2.5 FOXO3基因的表達與DNA錯配修復系統基因突變的關系

我們通過Sangerbox 單基因數據分析平臺，利用TCGA 的表達譜數據評估了5 個錯配修復系統(mismatch repairs，MMRs)基因：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM突變與FOXO3基因表達的關系。結果顯示：在包括膀胱癌在內的多數腫瘤中，FOXO3基因表達與MMRs基因的突變均呈現顯著正相關(P＜0.05或P＜0.01)，圖6。

圖4 FOXO3表達與膀胱癌免疫細胞浸潤的關系

圖6 FOXO3表達與DNA錯配修復系統基因表達的相關性

2.6 FOXO3蛋白相互作用網絡

String數據庫中使用PPI網絡分析，得到具有11個節點數的FOXO3 蛋白互作網絡(圖7)，其中與FOXO3相 互 作 用 的 蛋 白 (score＞0.900)包 括 AKT1、 SIRT1、EP300、 BCL2L11、 SOD2、 SGK1、 AKT2、 CREBBP、CDKN1B、SMAD4，大多數均參與細胞增殖、細胞凋亡、細胞自噬和細胞代謝等生理功能。

3 討 論

圖7 FOXO3蛋白相關的PPI網絡圖

膀胱癌具有較高的發病率和病死率，早期發現、診斷、治療和預后預測可以顯著改善患者的生命質量。目前對膀胱癌的手術、放化療等綜合治療已獲得相當的療效，但存在手術治療復發率高、放療和化療不良反應較大、放化療耐藥和轉移、預后差等問題，因此急需開展新的研究，發現有效的診斷標志物和診斷方法。

FOX轉錄因子家族通過對轉錄過程的特異性激活參與調節細胞周期進程、能量代謝及腫瘤發生[3]。在FOXO 亞家族中研究最多的是FOXO3，研究發現FOXO3的表達水平與多種腫瘤密切相關。與正常和良性腫瘤組織相比，高級別前列腺癌中FOXO3的表達和活性均受到抑制[11]；AN等[12]發現SIRT1-AMPK/FOXO3信號通路在逆轉胃癌的化學抗性和腫瘤干細胞特性方面具有重要作用；LIU 等[13]發現FOXO3 可以通過抑制Nrf2/TR1 信號通路和增加細胞內活性氧的水平來逆轉結腸癌對5-氟尿嘧啶的耐藥性；同時也有研究發現FOXO3高表達與膠質母細胞瘤的進展有關，且其預后較差[14]。

FOXO3與膀胱癌的相關研究日益受到關注。本研究通過GEPIA數據庫分析發現FOXO3在膀胱癌組織的表達低于正常組織，這與相關文獻[15]通過免疫組織化學實驗得到的“FOXO3在膀胱癌組織中的表達低于其癌旁組織”結論是相符的。另外還有研究報道腫瘤抑制基因Nkx2.8通過上調FOXO3 的表達能夠抑制膀胱癌細胞的增殖[16]；Polyphyllin I 可通過激活FOXO3 信號傳導途徑抑制膀胱腫瘤生長[17]。以上研究表明，FOXO3 信號途徑與膀胱癌的發生發展密切相關，FOXO3在膀胱癌組織中低表達使其有望作為膀胱癌的診斷標志物。我們進一步利用GEPIA數據庫進行生存分析，發現膀胱癌患者中FOXO3高表達組患者總生存率和無疾病生存率較FOXO3低表達組顯著降低，提示其表達與患者預后密切相關。通過UALCAN數據庫分析發現FOXO3在膀胱癌無淋巴結轉移組(N0)和淋巴結轉移組(N1，N2，N3)之間的表達差異無統計學意義，表明FOXO3在膀胱癌患者中的低表達與腫瘤是否發生淋巴結轉移沒有特定的關系。

腫瘤免疫微環境在腫瘤的發生發展過程中具有重要作用[18]。本研究利用TIMER數據庫分析發現FOXO3基因表達與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的免疫浸潤水平均有顯著的正相關性，表明FOXO3有可能參與膀胱癌細胞的免疫浸潤過程。有文獻[19]報道FOXO1能促進B細胞的分化、增殖、存活，但FOXO3 對B 細胞的作用不大，這與數據庫的分析結果不一致，所以非常有必要深入研究FOXO3與這些免疫細胞浸潤水平的關系。進一步在GEPIA平臺分析發現在膀胱癌中FOXO3基因與NRP1、CD200R1、CD276、CD160這 4 個免疫檢查點基因的表達水平有顯著正相關性。因此關注FOXO3表達與免疫檢查點基因表達水平的關系可以為膀胱癌免疫治療提供新的方向。此外，MMRs 為細胞內的錯配修復機制，該機制的關鍵基因功能喪失會導致DNA復制錯誤無法被修復，進而導致較高的體細胞突變的產生[20]。我們利用TCGA 表達譜數據分析發現FOXO3 表達與膀胱癌細胞中5 個錯配修復基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM)突變有顯著正相關性。這也為FOXO3在膀胱癌的研究提供了新思路。

FOXO3 信號途徑參與多種腫瘤的發生發展過程。我們使用String 數據庫預測與FOXO3 相互作用的蛋白，這些蛋白主要有AKT1、SIRT1、EP300、BCL2L11、SOD2、SGK1、AKT2、CREBBP、CDKN1B、SMAD4。其中，AKT 可抑制FOXO3 的轉錄活性，導致FOXO3向核外轉移并被泛素-蛋白酶體途徑降解，從而抑制前列腺癌細胞凋亡[21]，表明靶向AKT 信號可以促進腫瘤細胞的凋亡。在膀胱癌中，microRNA-608可以通過激活AKT/FOXO3 信號誘導細胞周期阻滯于G1 期來抑制癌細胞的增殖[22]。此外，SIRT1 低表達與胃癌患者預后不良有關，SIRT1 通過激活AMPK/FOXO3 信號途徑抑制腫瘤細胞化療耐藥[12]；在乳腺癌細胞中過表達EP300能夠上調FOXO3的活性，從而增加細胞對拉帕替尼的敏感性[23]；在前列腺癌細胞中，FOXO3位點的磷酸化可以抑制SGK1 誘導的細胞自噬和凋亡[24]。FOXO3與部分蛋白分子的關系是在非腫瘤模型中進行的，如在哺乳動物卵巢中，FOXO3通過促進卵巢顆粒細胞凋亡來調節卵泡閉鎖和卵泡生長，FOXO3表達下調會降低促凋亡因子BCL2L11 的mRNA 水平[25]；在骨性關節炎模型中，FOXO3 過表達可誘導SOD2 和過氧化氫酶的表達，從而抑制軟骨損傷的發展[26]；FOXO3還可通過激活CDKN1B(p27kip1)的表達來調節成年大鼠脊髓損傷后的再生[27]。膀胱癌中FOXO3與這些蛋白分子之間的相互作用鮮有報道，它們的具體作用機制需要進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究通過對生物信息學數據庫的挖掘，發現FOXO3在膀胱癌組織中呈低表達，腫瘤患者中高表達與患者的不良預后密切相關；FOXO3有可能參與膀胱癌細胞免疫浸潤過程，并與部分免疫檢查點基因的表達水平有顯著正相關性；FOXO3表達與DNA錯配修復基因的突變關系密切；FOXO3通過與其他蛋白的相互作用參與細胞增殖、凋亡、自噬和代謝等過程。這些表明FOXO3有望成為膀胱癌的診斷標志物和治療靶標。FOXO3作為一個潛在的抑癌基因，有必要深入研究該基因在膀胱癌中的作用機制和功能，以期為FOXO3在膀胱癌中的靶向治療提供理論基礎。