活動性結核患者CD4+T淋巴細胞的影響因素及診斷價值

冉仁玉 李奎

陜西省安康市中心醫院感染性疾病科（陜西安康725000）

結核病是單一病因所致病死率最高的傳染 病，也是全球不容忽視的公共衛生問題。其發病機制復雜，免疫功能低下是誘發結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染的高危因素之一［1］，同時慢性炎癥又會導致T 細胞功能障礙［2］，二者相互協同作用增加了MTB 感染及進展的風險。為了具體了解活動性結核（active tuber?culosis，ATB）患者外周血CD4+T 淋巴細胞與臨床特征的關系，本研究對確診ATB 患者的相關資料進行了橫斷面評估，旨在識別影響ATB 患者免疫功能低下的危險因素，并評估危險因素的潛在診斷價值。當缺乏CD4+T 檢測結果時，以期為臨床提供方便、快捷的評估指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析了2016年10月1日至2018年6月30日經病原學確診的ATB 患者282 例。本研究已通過醫院倫理委員會的批準（ECACH?2016012）。納入標準：（1）痰或體液MTB?DNA/RNA 檢測陽性；（2）痰涂片抗酸桿菌染色陽性；（3）痰分枝桿菌培養陽性且菌種鑒定為MTB；（4）有肺部CT 掃描檢查結果；（5）外周血T 淋巴細胞亞群分析檢查結果。排除標準：（1）膽紅素≥2倍正常值上限者（2 例）；（2）HIV 抗體陽性（2 例）；（3）非結核分枝桿菌肺病者（1 例）；（4）合并肝硬化或腫瘤者（2 例）；（5）正在使用免疫抑制劑者（0 例）。

1.2 方法

1.2.1 分組及觀察內容根據CD4+T細胞檢測結果，將患者分為免疫功能正常組（CD4+T 細胞≥404 個/μL）和免疫功能低下組（CD4+T 細胞＜404 個/μL）。收集患者的基本情況（包括性別、年齡等）、常規檢查（血常規、紅細胞沉降率等）、血清蛋白電泳（白蛋白、a1 球蛋白等）及細菌學（藥敏試驗結果、痰菌載量）4個方面的22種變量的數據。

1.2.2 相關定義空洞定義為胸部CT 掃描肺實質內至少有長徑≥5 mm 的含氣透光區，周圍有大于1 mm 的浸潤灶或纖維化壁。吸煙及粉塵暴露史定義為診斷肺結核前吸煙及粉塵暴露持續時間≥3 個月。合并肺外結核指在肺以外的器官和部位發現結核病變。糖尿病診斷標準為隨機血糖≥11.1 mmol/L 或空腹血糖≥7.0 mmol/L［3］。結核病診斷標準、治療史及荷菌量標準遵照《傳染性肺結核診斷標準及處理原則》報告［4］。

1.2.3 變量檢測CD4+T 淋巴細胞的檢測：采用邁瑞流式細胞儀（Mindray flow cytometer BriCyte E6）檢測平臺及BD 公司的淋巴細胞檢測試劑盒。樣本保存和轉運過程中處于室溫（20～25 ℃），標本離體后48 h 內進行實驗，在染色后24 h 內進行上機檢測。主要步驟如下：（1）采集空腹EDTA 抗凝靜脈血5 mL 后充分混勻血樣；（2）在試管中加入20 μL Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 試劑；（3）吸取50 μL EDTA 抗凝靜脈血分別加入試管底部（避免將血樣沾到試管壁上）；（4）試管在渦旋混勻器上輕旋混勻，室溫下避光孵育15 min；（5）向試管中加入450 μL 溶血素，在渦旋混勻器上輕旋混勻，室溫下避光孵育15 min；（6）上機自動檢測。

1.3 統計學方法應用SPSS 22.0 軟件（IBM SPSS Statistics）進行統計學分析。數據為正態分布以均數±標準差表示，非正態分布以中位數M（P25，P75）表示。計數資料的組間比較采用χ2檢驗；呈正態分布的計量資料的組間比較采用t檢驗，呈偏態分布的計量資料的組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。缺失值采用系列均值替代。再將差異具有統計學意義的變量進行多因素Logistic 回歸分析（Forward：LR 法），對模型的擬合度進行Hosmer?Lemeshow Test（HL 檢驗），通過Pearson 相關系數r風險因素與CD4+T 淋巴細胞的相關程度［5］。以免疫功能正常組為參照標準，應用受試者工作特征曲線（receive operating characteristic，ROC）判定獨立危險因素評估免疫功能低下的診斷效能。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者的一般情況在275 例患者中，男217 例（78.91%），女58 例（21.09%），年齡范圍15～84 歲，平均年齡54（38，66）歲，平均體質量指數（BMI）19.23（17.53，20.96）kg/m2，平均CD4+T 淋巴細胞300.00（203.00，437.00）個/μL。免疫功能正常組80例（29.09%），平均CD4+T淋巴細胞539.00（466.25，603.50）個/mL；免疫功能低下組195 例（70.91%），平均CD4+T淋巴細胞249.00（162.00，314.00）個/mL。

2.2 CD4+T 淋巴細胞影響因素的單因素篩選結果顯示性別、吸煙史、粉塵暴露史、合并糖尿病、病程、白細胞等14 項指標在兩組之間比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。免疫功能低下組患者在合并肺外結核、年齡、紅細胞沉降率、a1 球蛋白顯著高于正常組（均P＜0.05），而BMI、血紅蛋白、白蛋白、β1 球蛋白顯著低于正常組（均P＜0.05），見表1、2。

2.3 CD4+T 淋巴細胞影響因素的多因素Logistic回歸分析將以上在兩組間差異具有統計學意義的8 個變量賦值后（因變量：低下組=0，正常組=1；自變量：無肺外結核=0，有肺外結核=1，其余自變量為定量變量）納入Logistic 回歸分析。結果顯示，模型擬合的較好（χ2=4.520，P=0.807），預測準確性為71.6%；白蛋白和β1 球蛋白是免疫功能低下者的獨立危險因素；在調整白蛋白的混雜作用后，β1 球蛋白每下降一個單位風險增加1.508 倍；調整β1 球蛋白的混雜作用后，白蛋白每下降一個單位風險增加1.094 倍，見表3。

2.4 獨立危險因素與CD4+T淋巴細胞的相關性通過相關性分析發現，白蛋白與CD4+T 淋巴細胞計數呈中度相關（R=0.410，P＜0.001，圖1），β1 球蛋白與CD4+T淋巴細胞計數呈低度相關（R=0.289，P＜0.001，圖2）。

2.5 獨立危險因素診斷ATB 免疫功能低下的效能ROC 分析顯示，白蛋白和β1 球蛋白診斷免疫功能低下的效能較低，白蛋白效能優于β1 球蛋白，見圖3及表4。白蛋白具有較高靈敏度和陰性預測值、其檢測大于最佳臨界值的結果說明ATB者免疫功能低下的可能性不大，其靈敏度優于β1球蛋白，而β1 球蛋白的特異度優于白蛋白，見表4。

表1 275 例患者的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of 275 patients 例（%）

表2 275 例患者的臨床特征Tab.2 Clinical characteristics of 275 patients M（Q25，Q75）

表3 免疫功能低下患者的Logistic 回歸分析結果Tab.3 Logistic regression analysis results of patients with low immune function

3 討論

本研究中198 例（72.0%）患者白蛋白低于正常值（< 35.0 g/L），這比BISASO 等［6］報告結核感染患者基線白蛋白降低了44.2%，這可能與本地區結核患者重癥率及就診延遲率較高有關。ATB 患者白蛋白降低的機制可能為：（1）由于胃腸功能紊亂、食欲減退導致營養物質攝入減少，造成合成代謝降低。（2）MTB 利用機體蛋白用于自身代謝，菌體物質引起機體反復發熱、盜汗等消耗性改變，致分解代謝增加。因此，重視白蛋白水平的變化（< 29.62 g/L）將有助于對患者免疫狀態的了解，采取適當的干預措施可能對疾病恢復有利。同時本研究中29.1%（80/275）患者淋巴細胞數量未見減少，這可能與T 細胞抑制受體（如程序性死亡受體1、T 細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域蛋白?3、淋巴細胞活化基因?3 等）表達上調，抑制了T 細胞功能發揮，導致免疫癱瘓有關［7］。

表4 獨立危險因素評估免疫功能低下患者的效能Tab.4 Performance of independent risk factors for evaluating the patients with low immune function

圖1 白蛋白與CD4+T 淋巴細胞計數的相關性 Fig.1 The correlation between albumin and CD4+ T lymphocyte counts

圖2 β1 球蛋白與CD4+T 淋巴細胞計數的相關性 Fig.2 The correlation between CD4+T lymphocyte counts andβ1 globulin

圖3 白蛋白和β1 球蛋白評估免疫功能低下的受試者工作特征曲線Fig.3 Receiver?operating characteristics of patients with low immune function were evaluated by albumin and β1 globulin

β1 區帶球蛋白主要由轉鐵蛋白、血紅素結合蛋白、β脂蛋白和補體C4 組成。轉鐵蛋白和血紅素結合蛋白涉及鐵的轉運和儲存，在急性時相反應中及營養不良時常隨著白蛋白同時下降。前期MINCHELLA 等［8］也發現低轉鐵蛋白是MTB 潛伏性感染者發展成為ATB 的危險因素，本研究中β1球蛋白低于正常值下限（< 3.4 g/L）比例為35.95%（87/242），血紅蛋白下降率51.64%（142/275），這二者對CD4+T 淋巴細胞的影響均存在差異，而多因素分析結果顯示僅有β1 球蛋白是免疫功能低下的獨立危險因素，提示β1 球蛋白可能通過對機體免疫功能的影響促使結核活動，其影響程度比血紅蛋白更大。β1 球蛋白影響機體免疫功能可能為：轉鐵蛋白和血紅素結合蛋白的下降，從而使進入骨髓中的轉鐵蛋白?Fe3+減少；另一方面，MTB 感染時病原體通過合成高親和力鐵螯合物和在細胞表面表達甘油醛?3?磷酸脫氫酶受體而從宿主鐵載體蛋白中獲取鐵［9］；從而使機體鐵缺乏而導致淋巴細胞DNA 合成抑制、CD4+T 淋巴細胞增殖分化異常、巨噬細胞抗菌效應及粒細胞的殺菌能力下降［10］。β脂蛋白隨血漿蛋白的丟失可下降，其最終變化取決于肝細胞補償性合成作用，具有不可預知性，而在炎癥和感染中補體C4 呈上升改變。本研究中β1 球蛋白水平與CD4+T 淋巴細胞數量具有低度正相關性，升高的補體C4 可能抵消和掩蓋了轉鐵蛋白與CD4+T 淋巴細胞數的相關性，結核活動與轉鐵蛋白的關系值得進一步研究。未來調節機體鐵的失衡和阻斷MTB 的鐵供應，可能是拯救耐藥結核和提高現有抗結核藥物有效性的潛在策略［11］。

本研究顯示，肺外結核、年齡增加、高紅細胞沉降率和a1 球蛋白對CD4+T 淋巴細胞的影響具有意義。ALMEIDA 等［12］報告肺外結核中CD4+T 淋巴細胞呈下降改變，但與肺結核之間差異無統計學意義，而筆者認為原因可能與樣本量、檢驗效能有關。隨著年齡的增加，T 細胞增殖下降，本研究結果與國外的研究結果［13］類似。a1 區帶球蛋白主要由a1 抗胰蛋白、a1 酸性糖蛋白、a1 脂蛋白和甲胎蛋白組成。a1 抗胰蛋白和a1 酸性糖蛋白為急性相反應蛋白［14］，ZHANG 等［15］報道ATB 患者a1 酸性糖蛋白是血清中發現差異最大的蛋白峰，肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡細胞是最重要的細胞來源［16］。本研究中78.10%（189/242）的a1 球蛋白大于正常值上限（3.5 g/L），這與近期研究結果一致［17］，在多因素分析與同樣屬于炎性反應標志物的紅細胞沉降率因效果不顯著而被篩選掉，其對CD4+T 淋巴細胞的影響不及β1 球蛋白。

本研究的局限性：第一，僅對影響CD4+T 淋巴細胞數量變化的因素進行了分析，缺乏對功能障礙的研究；第二，解釋CD4+T 淋巴細胞變異的信息量較低，其他未知因素有待進一步探索；第三，未進一步對β1 區帶球蛋白按不同成分進行細化研究，未控制補體C4 成分的混雜影響，這可能低估了轉鐵蛋白和血紅素結合蛋白對免疫功能的影響；第四，納入分析的均為住院確診的ATB 患者，研究結果不一定適用于臨床診斷或疑似肺結核病例。

綜上所述，本研究報告了β1 球蛋白對ATB 患者免疫功能的影響，并進一步得到白蛋白和β1 球蛋白評價免疫功能的最佳臨界值，這一結果對評估結核病患者的免疫狀態有一定的臨床意義。結果表明，白蛋白和β1 球蛋白水平降低是影響ATB患者免疫功能低下的獨立危險因素，但其診斷效能較低，在缺乏CD4+T 淋巴細胞檢查結果時，應各取所長、優勢互補，其最大使用價值可能是支持性的診斷作用。