通絡軟堅膠囊配合熊去氧膽酸對自身免疫性肝病患者肝功能及血清Th17與Treg表達的影響

沈麗賢 李學 李惠文 王曉玲 張亞芹 吳淑娜 李瑤 田甜甜

河北中醫肝病醫院肝病一科（石家莊050800）

自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，ALD）是一種以肝臟損害為特征的慢性疾病，包括自身免疫性肝炎（AIH）、原發硬化性膽管炎（PSC）、原發膽汁性肝硬化（PBC）［1］。近年來，中醫學辨證施治在ALD 治療方面展現出良好前景，中醫學認為ALD 的病因病機為本虛標實，本虛為陰虛、陽虛、或陰陽兩虛，標實為痰瘀阻絡［2-3］。臨床中多采用熊去氧膽酸治療，它是一種無毒的親水性膽酸，具有改善ALD 患者肝功能、抑制肝纖維化的作用，但整體效果不盡理想［4］。中藥制劑通絡軟堅膠囊具有益氣通絡、活血化瘀、祛痰軟堅之功效，適用于ALD 的治療。此外，相關研究指出，T 細胞17（T helper cell 17，Th17）與調節性T 細胞（T regu?latory cell，Treg）的失衡在ALD 的發生發展中具有重要促進作用［5-6］。基于此，本研究初次聯合熊去氧膽酸及通絡軟堅膠囊對ALD 患者實施治療，從血清Th17 與Treg 表達等方面探究其應用效果。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月至2018年10月我院120 例ALD 患者進行前瞻性研究，依據隨機數字表法分為研究組與對照組，各60 例。兩組性別、年齡、病程、體質量、病情分期、合并癥對比，差異均無統計學意義（P> 0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Clinical characteristics of patients in two groups例（%）

1.2 病例選擇標準納入標準：（1）符合ALD 診斷標準［7］；（2）中醫辨證分型為脾氣虧虛、痰瘀阻絡證；（3）初發ALD；（4）年齡18～60 歲；（5）自身抗體陽性，肝功能異常；（6）肝功能Child?pugh 分級A級；（7）患者知曉本研究，已簽署同意書。排除標準：（1）病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝炎等其他肝臟疾病患者；（2）精神系統疾病患者；（3）有肝膽手術史者；（4）近期采用免疫抑制劑等其他藥物治療者，或對本研究藥物過敏者；（5）嚴重消化系統疾病、血液系統疾病患者；（6）心肺腦腎功能嚴重不全者；（7）膽道完全阻塞者；（8）不能配合完成研究者；（9）妊娠或哺乳期女性。

1.3 治療方法兩組患者均予對癥支持治療和糖皮質激素治療，在此基礎上，對照組采用熊去氧膽酸（湖北潛龍藥業有限公司，國藥準字H42021252，規格：50 mg/片）治療，口服，250 mg/次，3 次/d。研究組于對照組基礎上采用通絡軟堅膠囊（河北中醫肝病醫院制劑室生產，批準文號：冀藥制字Z20050531，規格：0.4 g/粒），口服，2.8 g/次，2 次/d。兩組均以3 個月為1 個療程，持續治療4 個療程，治療期間忌食油膩、辛辣刺激性食物，忌酒。

1.4 觀察指標

1.4.1 兩組臨床效果4 個療程結束后進行評估，評估標準［8］：顯效：患者癥狀及體征明顯改善，肝功能及血清免疫球蛋白指標較治療前改善>50%；有效：癥狀及體征較前有好轉，肝功能及血清免疫球蛋白指標較治療前改善>30%～50%；無效：未達以上標準；（顯效+有效）/總例數×100%=總有效率。

1.4.2 兩組治療前、治療后肝功能指標采集患者空腹狀態下外周靜脈血8 mL，置于長沙湘智離心機儀器有限公司生產的TDZ6?WS 型離心機上，以3 500 r/min 轉速、8 cm 半徑離心處理5 min，取血清，均分成4 份，置于-70 ℃冰箱內備用，取血清標本，由專業檢測師采用德國西門子BNII 全自動生物化學分析儀測定肝功能指標水平。包括血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotrans ferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ala?nine aminotransferase，ALT）水平。

1.4.3 兩組治療前、治療后肝纖維化指標包括Ⅳ型膠原（Ⅳ?collagen，Ⅳ?C）、Ⅲ型前膠原（procol?lagen?Ⅲ，PC?Ⅲ）、層粘連蛋白（laminin，LN）、透明質酸（hyaluronic acid，HA），取血清標本，采用放射免疫法測定上述指標水平，試劑盒購自德國歐蒙醫學實驗診斷有限公司。

1.4.4 兩組治療前、治療后免疫指標包括免疫球蛋白M（Immune globulin M，IgM）、IgG，取血清標本，采用免疫熒光法檢測血清IgM、IgG 水平，試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4.5 兩組治療前、治療后血清Th17、Treg、Th17/Treg 表達取血清標本，采用貝克曼Coulter Epics XL 型流式細胞儀測定上述指標表達情況。

1.4.6 兩組不良反應觀察記錄2 組患者治療期間低血鉀、腹瀉、皮疹、頭暈頭痛、惡心嘔吐等不良事件發生情況。

1.5 統計學方法數據處理采用SPSS 22.0 軟件，呈正態分布的計量資料以（±s）表示，治療前后比較采用配對t檢驗，2 組之間采用成組t檢驗；計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗，P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床效果比較治療4 個療程后，研究組總有效率為95.00%，顯著高于較對照組的81.67%，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組臨床效果比較Tab.2 The comparison of the curative effect between two groups 例（%）

2.2 肝功能比較治療前兩組血清TBIL、DBIL、AST、ALT 水平差異無統計學意義（P>0.05），治療后兩組血清TBIL、DBIL、AST、ALT 水平較治療前降低，且研究組低于對照組（P<0.05）。見表3。

表3 兩組肝功能指標比較Tab.3 The comparison of liver function indicators between two groups ±s

表3 兩組肝功能指標比較Tab.3 The comparison of liver function indicators between two groups ±s

注：與同組治療前對比，aP<0.05

時間治療前例數60 60治療后組別研究組對照組t 值P 值研究組對照組t 值P 值60 60 TBIL（μmol/L）76.31±8.34 74.91±7.98 0.940 0.349 31.53±5.30a 40.32±6.23a 8.324<0.001 DBIL（μmol/L）137.28±56.75 140.31±53.64 0.301 0.764 20.56±5.07a 28.29±6.69a 7.133<0.001 AST（U/L）141.38±29.37 139.40±31.26 0.358 0.721 35.15±8.21a 46.80±7.31a 8.209<0.001 ALT（U/L）218.34±33.40 221.91±35.64 0.566 0.572 37.50±7.67a 53.71±8.51a 10.960<0.001

2.3 肝纖維化比較治療前兩組血清Ⅳ?C、PC?Ⅲ、LN、HA 水平差異無統計學意義（P>0.05），治療后兩組血清Ⅳ?C、PC?Ⅲ、LN、HA 水平較治療前降低（P< 0.05），且研究組低于對照組（P< 0.05）。見表4。

2.4 血清IgM 及IgG 水平比較治療前兩組血清IgM 及IgG 水平差異無統計學意義（P>0.05），治療后兩組血清IgM 及IgG 水平較治療前降低，且研究組低于對照組（P<0.05）。見表5。

2.5 血清Th17、Treg 及Th17/Treg 表達比較治療前兩組血清Th17與Treg、Th17/Treg表達差異無統計學意義（P>0.05），治療后兩組血清Th17與Th17/Treg 表達較治療前降低，血清Treg 表達較治療前增高，且研究組血清Th17 與Th17/Treg 表達低于對照組，血清Treg表達高于對照組（P<0.05）。見表6。

表4 兩組肝纖維化指標比較Tab.4 The comparison of the liver fibrosis indicators between two groups ±s，μg/L

表4 兩組肝纖維化指標比較Tab.4 The comparison of the liver fibrosis indicators between two groups ±s，μg/L

注：與同組治療前對比，aP<0.05

時間治療前例數60 60治療后組別研究組對照組t 值P 值研究組對照組t 值P 值60 60Ⅳ?C 196.21±34.14 194.41±32.35 0.296 0.767 103.20±23.21a 130.14±25.35a 6.071<0.001 PC?Ⅲ210.39±52.50 208.25±49.38 0.230 0.819 100.07±25.39a 129.64±30.14a 5.812<0.001 LN 181.12±46.45 178.70±44.69 0.291 0.772 111.78±36.40a 132.23±40.36a 2.915 0.004 HA 271.68±50.01 268.91±46.93 0.313 0.755 94.85±33.03a 115.73±36.21a 3.300 0.001

表5 兩組血清IgM 及IgG 水平比較Tab.5 The comparison of the serum IgM&IgG between two groups ±s，g/L

表5 兩組血清IgM 及IgG 水平比較Tab.5 The comparison of the serum IgM&IgG between two groups ±s，g/L

注：與同組治療前對比，aP<0.05

組別研究組對照組t 值P 值例數60 60 IgM治療前5.59±2.16 5.83±2.04 0.626 0.533治療后1.41±0.96a 2.98±1.01a 8.727<0.001 IgG治療前30.39±6.25 28.91±5.97 1.326 0.187治療后14.53±4.41a 20.29±5.56a 6.287<0.001

表6 兩組Th17 與Treg 表達比較Tab.6 The comparison of the Th17&Treg between two groups ±s

表6 兩組Th17 與Treg 表達比較Tab.6 The comparison of the Th17&Treg between two groups ±s

注：與同組治療前對比，aP<0.05

時間治療前例數60 60治療后組別研究組對照組t 值P 值研究組對照組t 值P 值60 60 Th17（%）4.41±1.06 4.36±1.10 0.254 0.800 0.95±0.34a 1.38±0.44a 5.990<0.001 Treg（%）2.92±0.87 2.89±0.90 0.186 0.853 6.51±1.50a 4.40±1.39 7.992<0.001 Th17/Treg 1.51±0.51 1.50±0.49 0.120 0.913 0.15±0.06a 0.31±0.15a 7.671<0.001

2.6 不良反應比較兩組患者治療過程中均發生輕微不良反應，不良反應總發生率對比差異無統計學意義（P>0.05）。見表7。

表7 兩組不良反應比較Tab.7 Comparison of adverse reactions between two groups例（%）

3 討論

ALD 是一種特殊類型的肝臟疾病，多發于青中年女性，臨床普遍認為發病率較低，診斷較為困難，尚缺乏統一有效的治療方案，是目前的難點和熱點疾病。英國新近一項研究表明，其發病率為2.8/10 萬，女性高于男性，年老者高于年輕人群。10年累積全因病死率為31.9%［9］。ALD 的基礎病理改變是一種炎性反應，臨床表現為轉氨酶升高，抗核抗體、抗平滑肌抗體陽性，免疫球蛋白G升高［10］。ALD 發病機制復雜，目前存在各種假說和理論，包括感染與分子模擬學說、自身免疫紊亂學說，另外，關于遺傳因素在其發病中的作用也多有報道［11-12］。BIEWENGA 等［13］研究發現補體系統在ALD 的發病中亦扮演了重要的角色。各種免疫因子目前尚無特異性生物學標志物或組織學標志物，患者只能做出臨床診斷。對于ALD 的治療，常規治療以糖皮質激素或免疫抑制劑為主，一線用藥推薦硫唑嘌呤，但長期應用激素治療不良反應多，患者耐受性差。對反應不完全或不耐受者，可予應用麥考酚酯，亦能獲得一定療效［14-15］。

近年來，熊去氧膽酸在肝膽疾病中的作用越來越受臨床重視，該藥物呈弱堿性，口服后通過被動擴散迅速吸收，可競爭性抑制毒性內源性膽酸在回腸的吸收，同時能競爭性取代細胞膜和細胞器上毒性膽酸分子，防止肝細胞和膽管細胞受到毒性膽酸的損害，發揮保護、改善肝功能的作用［16］。此外，熊去氧膽酸通過降低疏水膽酸的刺激作用間接抑制組織相容性復合體Ⅰ類和Ⅱ類基因的表達，并通過激活糖皮質激素受體直接抑制上述基因的表達，發揮免疫調節作用。本研究將熊去氧膽酸應用于ALD 患者，治療總有效率為81.67%，可見其治療效果良好，但仍有可提升空間。

中醫學經典中無自身免疫性肝病記載，通過臨床辨證多將其歸屬于“黃疸”“脅痛”“痞滿”“臌脹”等范疇，認為ALD 屬本虛標實，本虛以肝腎陰虛為主，標實以濕熱為主，并夾氣滯、血瘀等，伴隨沖任虛損、氣血不足、陰陽失調、陰血不足等生理病理改變，又復感濕熱之邪，肝絡郁滯而發病，濕毒之邪易留滯，濕阻脾胃，正虛邪戀，氣機郁滯，血運不暢，又可形成瘀血，終成本虛標實、虛實夾雜之證候［17］。針對此病因病機，應遵循益氣健脾、活血化瘀、軟堅散結、疏肝通絡的治療原則。通絡軟堅膠囊由炙黃芪、鱉甲、穿山甲、丹參等諸味中藥組成，方中鱉甲咸寒，入肝脾血分，具有軟堅散結、滋陰清熱之功效，穿山甲可透達經絡，二者為本方主藥，合用可通絡軟堅、消癥化積；炙黃芪具有益氣健脾之功效，牡蠣化痰軟堅，桃仁、丹參、澤蘭能活血祛瘀，絲瓜絡解毒通絡、清熱涼血，佐以當歸養血柔肝、活血化瘀，小薊涼血止血、清熱解毒，郁金辛開苦降、芳香宜達，既入氣分以行氣解郁，又入血分以涼血逐瘀，且能引諸藥直達肝經。全方合用，具有益氣健脾、活血通絡、化痰軟堅之功效。現代藥理學研究表明，鱉甲中含有鱉多糖，具有免疫促進作用；穿山甲含硬脂酸、膽甾醇等多種成分，具有改善血液循環及抗炎等作用；黃芪中有效成分皂苷具有一定的改善微循環、抗炎及鎮痛作用；丹參有效成分具有改善肝微循環的作用，同時能抑制過度增生的纖維母細胞，起到抑制肝臟纖維化的作用［18］。基于此，本研究將通絡軟堅膠囊與熊去氧膽酸聯合應用于ALD 患者，結果發現二者聯合治療的總有效率提高至95.00%，且能進一步抑制肝纖維化，改善機體免疫功能，促進肝功能提高。

ALD 的發病與自身免疫反應有關，Th17 是機體防御方面的重要細胞因子，近年來其因參與介導多種自身免疫性疾病的發展而備受關注［19-20］。國外文獻研究［21］指出，自身免疫性肝炎患者外周血Th17 表達升高，Treg 表達下降，Treg 作為炎性介質在ALD 的發病中發揮著一定的作用，它通過甲基化修飾從而促進病情進展。另有研究發現ALD患者體內Treg甲基化水平高于正常人群［22］，也證明了這一觀點。Th17與Treg的動態平衡被打破，引發機體免疫功能紊亂，促進疾病的發生發展［23-25］。在ALD 患者體內，Th17 表達增加可促進白細胞介素22 等炎性因子在炎癥部位聚集，加重肝細胞損傷，加劇肝纖維化［26-27］。本研究發現，聯合應用通絡軟堅膠囊與熊去氧膽酸治療ALD 患者，能進一步降低Th17 與Th17/Treg 表達，增強Treg 表達，促進Th17 與Treg 的動態平衡恢復，從而改善肝功能，增強療效，這與通絡軟堅膠囊、熊去氧膽酸均具有改善機體免疫功能、抗炎等作用，聯合應用可發揮協同作用有關。本研究還發現加用通絡軟堅膠囊未明顯增加藥物不良反應，具有一定安全性。但本研究仍存在一定不足，如未進行長期隨訪，遠期療效尚未明確，有待日后進一步深入探究。

綜上可知，給予ALD 患者通絡軟堅膠囊聯合熊去氧膽酸治療的療效顯著，能進一步調節Th17與Treg 表達平衡，在改善機體免疫功能、抑制肝纖維化、增強肝功能等方面具有明顯優勢，且具有一定安全性，值得臨床推廣應用。