HPLC測(cè)定茵梔黃方劑中4味藥材的主要成分及含量

張玉姍,孫一斐,羅莉,李作銘,張珊滋,姚新成,2

(1.石河子大學(xué) 藥學(xué)院,新疆 石河子 832000; 2.新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000)

“茵梔黃”系列成方制劑由中醫(yī)古方“茵陳蒿湯”(出自張仲景《傷寒論》)衍生轉(zhuǎn)化而來(lái),主要用于膽汁淤積型肝臟疾病的退黃治療[1-3].該方由茵陳(濱蒿或茵陳蒿)、梔子、黃芩和金銀花4味藥材的提取物組成[4].該方中的4味藥材具有清熱利濕、瀉火解毒的功效,協(xié)同作用可退黃疸[5].現(xiàn)代藥理研究表明茵陳、梔子、黃芩和金銀花中含有多種具有保肝利膽和抗炎功效的活性成分[6].在臨床上,茵梔黃湯劑應(yīng)用了近百年,治療各種黃疸型肝炎療效確切,特別是針對(duì)新生兒膽汁淤積型黃疸病的退黃治療,效果尤為顯著.

茵梔黃復(fù)方所含的藥理活性成分復(fù)雜.邱小玉[7],張楠[8]等對(duì)茵梔黃口服液中的多個(gè)有效成分進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明新綠原酸、野黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和對(duì)羥基苯乙酮等成分含量的批間差異較大；張玉姍[9],陳永剛[10]等分別建立了HPLC同時(shí)對(duì)茵梔黃顆粒中多個(gè)化學(xué)成分含量測(cè)定的方法,研究表明不同批次顆粒劑中異綠原酸A、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷和千層紙素A等成分的含量具有一定差異.分析認(rèn)為造成差異的原因可能是不同批次的制劑所使用的原料藥材產(chǎn)地不同、采收時(shí)間不同、加工方法不一致等,從而導(dǎo)致提取物存在一定的質(zhì)量差異.以上研究主要集中在茵梔黃復(fù)方成劑，如注射液、顆粒、口服液等,極少報(bào)道測(cè)定復(fù)方藥材提取物含量的研究.目前2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部對(duì)茵梔黃復(fù)方的整體質(zhì)量控制仍比較局限,僅對(duì)茵陳提取物中的對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸、梔子提取物中的梔子苷,黃芩提取物中的黃芩苷和金銀花提取物中的綠原酸進(jìn)行了含量測(cè)定和質(zhì)量控制[4],僅測(cè)定這幾種成分難以充分反映和保證制劑批次間穩(wěn)定性.目前對(duì)于構(gòu)成茵梔黃復(fù)方藥材的研究多為直接對(duì)其純化分離進(jìn)而分析化學(xué)成分,極少建立對(duì)藥材標(biāo)準(zhǔn)提取物成分分析及含量測(cè)定的方法.對(duì)于4味藥材提取物有如下相關(guān)研究.張昀[11]、何峰[12]等用HPLC測(cè)定了舒肝寧注射液的茵陳提取物和梔子提取物中綠原酸及梔子苷的含量；丁芳林[13]等建立了測(cè)定黃芩超聲提取物中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的方法；陳有根[14]、范毅[15]等建立了測(cè)定金銀花提取物中綠原酸、3,5-二咖啡酰基奎寧酸和木犀草苷含量的方法,但這些研究所涉及的植物提取物多為超聲提取或按照其他復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)提取,與《中華人民共和國(guó)藥典》所記載茵梔黃復(fù)方中各味藥材提取物的制備方法相差甚遠(yuǎn).由于藥材在其加工過(guò)程中采用不同的提取工藝、制備方法均可導(dǎo)致活性成分的種類(lèi)和含量不同,故現(xiàn)有的研究不能作為衡量茵梔黃復(fù)方中藥材標(biāo)準(zhǔn)提取物質(zhì)量的依據(jù).

本研究在借鑒前人工作基礎(chǔ)上,采用HPLC對(duì)茵梔黃方劑中4味藥材的標(biāo)準(zhǔn)提取物(按照《中華人民共和國(guó)藥典》制取)進(jìn)行分析測(cè)定,又選取了新綠原酸、1.3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷及千層紙素A等指標(biāo)成分對(duì)這4種藥材的提取物進(jìn)行質(zhì)量控制,克服現(xiàn)有質(zhì)量控制指標(biāo)單一的不足,力求全面評(píng)價(jià)該復(fù)方,從藥材源頭有效保障制劑質(zhì)量,可用于茵梔黃系列產(chǎn)品的質(zhì)量提升.

1 儀器與材料

1.1 儀器

SSI HPLC色譜儀,1000型紫外檢測(cè)器(美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)儀器公司);迪馬公司Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ES 225SM-DR型十萬(wàn)分之一天平(SWISS MADE).

1.2 藥材與試劑

茵陳、梔子、黃芩、金銀花均購(gòu)自安徽藥知源中藥飲片有限公司,經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院李鵬副教授鑒定.茵陳為菊科植物茵陳蒿(ArtemisiacapillarisThunb.)的干燥地上部分;梔子為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis.)的干燥果實(shí);黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.)的干燥根莖;金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾.藥材樣品保存在石河子大學(xué)中藥學(xué)系植物標(biāo)本室.1,3-二咖啡酰奎寧酸(批號(hào)AF8030809)、異綠原酸B(批號(hào)AF7080124)、異綠原酸C(批號(hào)AF7060542)、梔子苷(批號(hào)AF7110308)、黃芩苷(批號(hào)AF7061702)、漢黃芩素(批號(hào)AF7121402)、黃芩素(批號(hào)AF8030808)、漢黃芩苷(批號(hào)AB7100922)、千層紙素A(批號(hào)AF7110209)、新綠原酸(批號(hào)AF7050442)均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;綠原酸(批號(hào)110753-200413)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;異綠原酸A(批號(hào)161022)購(gòu)自成都昂賽思生物科技有限公司.以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不低于98% (HPLC測(cè)定).甲酸、甲醇為分析純,乙腈為色譜純,水為超純水.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱;流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液(B),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL.茵陳提取物(YCE)洗脫條件(體積分?jǐn)?shù)):0～7 min,20% A;7～13 min,20%～25% A;13～20 min,25%～40% A,檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm.梔子提取物(ZZE)洗脫條件(體積分?jǐn)?shù)):0～5 min,15%～26% A;5～8 min,26%～31% A;8～19 min,31%～33% A,檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm.黃芩提取物(HQE)洗脫條件(體積分?jǐn)?shù)):0～5 min,15%～33% A;5～8 min,33%～37% A;8～25 min,37%～50% A;25～35 min,50%～55% A,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm.金銀花提取物(JYHE)洗脫條件(體積分?jǐn)?shù)):0～7 min,15%～20% A;7～10 min,20% A;10～12 min,20%～30% A;12～20 min,30%～40% A,檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm.

2.2 茵梔黃方劑中4味藥材提取物的制備

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》茵梔黃復(fù)方各味藥材標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備方法制備茵陳、梔子、黃芩和金銀花的提取物[4].提取物冷凍干燥,備用.

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸、1.3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、梔子苷、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A及新綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,精密稱(chēng)定,用甲醇分別配制成1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液,各對(duì)照品儲(chǔ)備液均用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,備用.依次精密吸取綠原酸、1.3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1 mL,黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1 mL,新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1 mL分別置于3個(gè)10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,混勻,即得混合對(duì)照品溶液A、B、C.將上述溶液于4 ℃保存,備用.

2.4 供試品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取茵陳、梔子、黃芩和金銀花提取物各0.20 g,置于50 mL的容量瓶中,加甲醇50 mL充分溶解,搖勻,過(guò)濾,棄去初濾液,取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜,即得.

2.5 茵梔黃提取物的化學(xué)成分分析

分別取“2.4”項(xiàng)下的供試品溶液及“2.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液按各色譜條件進(jìn)樣20 μL分析.

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,分別定量稀釋制備成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,以質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程見(jiàn)表1.

2.6.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取各混合對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積.

2.6.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

吸取同一供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積.

2.6.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別稱(chēng)取茵陳、梔子、黃芩和金銀花提取物適量,按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積.

2.6.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取6份已知含量的茵陳、梔子、黃芩和金銀花提取物各0.10 g,按各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%、120%分別加入對(duì)照品溶液,按“2.4”項(xiàng)下方法制成供試溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD.

2.7 樣品測(cè)定

分別稱(chēng)取3個(gè)批次的茵陳、梔子、黃芩和金銀花提取物適量,按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備3份供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定峰面積,代入回歸方程,計(jì)算各成分在樣品中的含量.

3 結(jié)果與分析

3.1 茵梔黃提取物的化學(xué)成分分析結(jié)果

如圖1-4所示,各提取物中的物質(zhì)峰分離度、峰形良好、基線平穩(wěn),經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)保留時(shí)間比對(duì)共確定14個(gè)化學(xué)成分.

1.綠原酸；2.1,3-二咖啡酰奎寧酸；3.異綠原酸B；4.異綠原酸A；5.異綠原酸C.

1.梔子苷.

1.黃芩苷；2.漢黃芩素；3.黃芩素；4.漢黃芩苷；5.千層紙素A.

1.新綠原酸；2.綠原酸；3.異綠原酸A.

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系

如表1所示,目標(biāo)成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

表1 茵梔黃方劑4味藥材提取物中各成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of components in the four medicinal materials of Yinzhihuang formula

3.2.2 精密度

YCE中綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD值分別為1.5%、0.78%、2.4%、1.9%、1.8%；ZZE中梔子苷峰面積的RSD值為2.1%；HQE中黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A峰面積的RSD值分別為2.3%、2.2%、1.5%、2.1%、2.0%；JYHE中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A峰面積的RSD值分別為1.2%、1.0%、1.5%,結(jié)果表明儀器精密度良好.

3.2.3 穩(wěn)定性

YCE中綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD值分別為2.4%、2.3%、2.4%、1.7%、2.1%；ZZE中梔子苷峰面積的RSD值為2.5%；HQE中黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A峰面積的RSD值分別為1.8%、0.2%、2.3%、2.1%、0.73%；JYHE中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A峰面積的RSD值分別為1.2%、1.7%、2.3%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

3.2.4 重復(fù)性

YCE中綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為28.09、10.20、8.754、10.02、6.119 mg/g,RSD值分別為1.9%、2.4%、1.7%、2.1%、2.1%；ZZE中梔子苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為292.3 mg/g,RSD值為0.87%；HQE中黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為275.5、6.173、29.96、15.69、6.337 mg/g,RSD值為1.8%、1.9%、2.2%、2.1%、2.3%；JYHE中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.245、24.81、28.91 mg/g,RSD值分別為2.1%、2.4%、2.2%,結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好.

3.2.5 加樣回收率

如表2所示,4味藥材提取物中各目標(biāo)成分的加樣回收率在95%～105%,RSD值均小于2.5%.

表2 加樣回收率結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery (n=6)

續(xù)表2Continue Tab.2

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果

表3為3個(gè)批次藥材(S1、S2、S3)所制提取物的含量測(cè)定結(jié)果.

表3 茵梔黃中主要化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.3 Determining results of main chemical components in Yinzhihuang (n=3)

4 結(jié)論

本研究采用HPLC對(duì)茵梔黃方劑4味藥材標(biāo)準(zhǔn)提取物中的綠原酸、1.3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、梔子苷、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、千層紙素A及新綠原酸等成分進(jìn)行了定性和定量分析,結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下,所測(cè)成分色譜峰與其他成分分離度良好,各項(xiàng)方法學(xué)驗(yàn)證符合要求,方法簡(jiǎn)便,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,為保證該方劑的安全性和有效性提供標(biāo)準(zhǔn),為該方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其藥材提取物主要化學(xué)成分的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)提供可靠依據(jù).