基于網絡藥理學的菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的作用機制研究

李錦英 張兆萍 葉金飛 曾麗華 梁蘊儀 朱玲

摘 要 目的：探討菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的潛在作用機制。方法：利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、GenenCards和OMIM數據庫獲得菟絲子-枸杞子藥對活性成分及卵巢早衰的相關靶點，利用Venn在線工具篩選兩者的交集基因，并采用Cytoscape 3.7.0軟件構建活性成分-靶點網絡和靶點間蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡;通過DAVID數據庫對交集基因進行基因本體（GO）富集分析和KEGG通路富集分析，最終構建活性成分-靶點-關鍵通路網絡。結果：篩選出菟絲子-枸杞子藥對活性成分42個，成分及疾病靶點231、1 913個，節點度值排名靠前的化合物有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、黃豆黃素、豆甾醇和芝麻素等。活性成分靶點與卵巢早衰疾病靶點的交集基因共149個，交集基因的PPI網絡共包含節點149個、邊2 970條，平均節點度值為39.9，平均介數值為0.005 4。GO分析結果顯示，上述交集基因的分子功能主要包括蛋白結合、酶結合等，生物過程主要涉及促進RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、促進DNA轉錄等，細胞組分主要包括細胞核、細胞質等，信號通路主要涉及癌癥信號通路、乙型肝炎通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。活性成分-靶點-關鍵通路網絡顯示，菟絲子和枸杞子的主要活性成分均為黃酮類及醇類，關鍵靶點有蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤抑制蛋白P53（TP53）、白細胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）等，通路主要涉及癌癥信號通路、乙型肝炎信號通路、PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等。結論：菟絲子-枸杞子藥對的多種活性成分可能通過PI3K/AKT信號通路、MAPK等多條通路作用于AKT1、TP53等多個靶點治療卵巢早衰，并挖掘出潛在活性成分豆甾醇、芝麻素以及潛在靶點IL6、TNF。

關鍵詞 菟絲子-枸杞子藥對;卵巢早衰;網絡藥理學;作用機制

中圖分類號 R285;R711.75 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）18-2202-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the potential mechanism of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus in the treatment of premature ovarian failure. METHODS： Main active components and related targets of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus in the treatment of premature ovarian failure were obtained from TCMSP， GeneCards and OMIM database. The intersection genes between them were screened using Venn online tool. Cytoscape 3.7.0 software was adopted to establish the active ingredients-target network and the PPI network. GO and KEGG pathway enrichment analysis on intersection genes were carried out by DAVID database. Finally， an active component-target-key pathway network was constructed. RESULTS： Totally 42 active components， 231 and 1 913 targets for active components and disease were obtained from couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus. The components with high node degree included quercetin，kaempferol，β-sitosterol，isorhamnetin，glycitein，stigmasterol and sesamin，etc.? There were 149 intersection genes between the active component targets and premature ovarian failure targets. PPI network contained 149 nodes and 2 970 edges，with an average node degree of 39.9 and an average medium of 0.005 4. The results of GO analysis showed that molecule function of the above-mentioned genes mainly involved protein binding，enzyme binding， etc. Biological process mainly included that positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter，positive regulation of transcription DNA-templated， etc. Cell components mainly included nucleus，cytoplasm，etc. Signaling pathway mainly involved cancer signaling pathway， hepatitis B signling pathway， PI3K/AKT signaling pathway，MAPK signaling pathway，etc. The results of active component-target-key pathway network showed that active components of Cuscutae Semen and Lycii Fructus were flavonoids and alcohols; key target included AKT1，TP53，VEGFA，IL6，TNF，etc. Signaling pathway mainly involved cancer signaling pathway， hepatitis B signaling pathway，PI3K/AKT signaling pathway，MAPK signaling pathway，etc. CONCLUSIONS： Through PI3K/AKT signaling pathway and MAPK signaling pathway，the active components of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus may act on AKT1，TP53 and other targets，and then play a therapeutic role on premature ovarian failure. The Potential active components stigmasterol， sesamin and potential targets IL6， TNF were found.

KEYWORDS? ?Couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus; Premature ovarian failure;Network pharmacology;Mechanism of action

卵巢早衰（Premature ovarian failure）是臨床上常見的生殖內分泌系統疾病，是指女性在40歲以前出現卵巢儲備功能下降甚至衰竭的現象，臨床主要表現為閉經、不孕、低雌激素癥等，部分患者還可出現潮熱多汗、煩躁不安、性欲低下、睡眠障礙、骨質疏松等圍絕經期癥狀[1]。據調查，我國卵巢早衰的發病率為1%～3%[2]，是臨床婦科醫師關注的熱點之一。現代醫學治療卵巢早衰主要有雌孕激素替代療法、免疫療法以及誘導排卵、卵巢冷凍移植等對癥治療方法[3]。而中醫認為，卵巢早衰屬“閉經”“不孕”“血枯”等范疇，病機總歸腎虛，治療當以補腎填精為主[4]。

網絡藥理學是藥理學的分支學科，其是在藥物、靶點、疾病相互作用的基礎上，通過網絡分析和生物信息技術等手段系統揭示多成分藥物治療疾病的相關機制[5]。該學科注重整體性、系統性和藥物之間的相互作用，這與中醫治病的整體觀念相吻合。網絡藥理學與中藥研究的結合，可為闡明中醫藥治療疾病的作用機制提供新的研究思路和方法，有利于揭示中藥治病的本質，并為中藥研發提供強有力的理論支撐，進而推動中醫藥現代化的發展[6]。

菟絲子-枸杞子藥對為左歸丸、歸腎丸、五子衍宗丸等治療卵巢早衰方劑的核心藥對，具有補腎填精的作用，臨床上多用菟絲子-枸杞子藥對治療腎虛型卵巢早衰，療效確切[7]。但菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的作用靶點及分子機制等尚不明確。為此，本研究擬借助網絡藥理學的方法探討該藥對治療卵巢早衰的潛在作用機制，旨在為臨床應用菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰提供基礎生物學信息支撐。

1 資料與方法

1.1 菟絲子-枸杞子藥對活性成分及靶點蛋白的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“Tu Si Zi”或“Cuscutae Semen”等為關鍵詞搜索菟絲子的主要化學成分，以“Gou Qi Zi”或“Lycii Fructus”等為關鍵詞搜索枸杞子的主要化學成分;以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為限定條件初步篩選其活性化合物，去除無明確作用靶點的成分后獲得活性成分。同時，提取其蛋白質靶點。此外，為標準化靶點蛋白信息，統一將靶點蛋白轉化成Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）的靶點。

1.2 卵巢早衰相關靶點的篩選

在 GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數據庫（http：//www.omim.org）中以“Premature ovarian failure”OR“POF”為關鍵詞檢索與卵巢早衰疾病相關的靶點基因，并記錄靶點基因的Score值（Score值越高代表靶點與疾病之間的關系越緊密）;依據文獻經驗[8]，若疾病靶點過多，則將Score值大于中位值的目標靶點作為卵巢早衰的潛在靶點。合并各數據庫的檢索結果，刪去重復值后獲得卵巢早衰靶點。

1.3 主要活性成分-疾病靶點網絡的構建

為明確菟絲子-枸杞子藥對活性成分靶點與卵巢早衰疾病靶點間的關系，利用Venn在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制韋恩圖，獲得菟絲子-枸杞子藥對活性成分靶點與卵巢早衰靶點的交集基因。將藥材活性成分靶點與交集基因通過Cytoscape 3.7.0軟件構建活性成分-疾病靶點網絡圖。以節點表示活性成分和靶點，節點之間的以邊相連;節點度值表示與節點相連邊的數量，其值越大，表示該節點在網絡中越重要（下同）。

1.4 交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡的構建

將交集基因導入STRING數據庫（https：//string-db.org），生物種類設定為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設定為“Highest confidence>0.9”，其余設置均為默認，構建PPI網絡圖，并通過Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化展示。

1.5 交集基因的富集分析

為闡明菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰潛在靶點在信號通路中的作用，采用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對交集基因進行基因本體（GO）富集分析和KEGG通路富集分析。限定物種為“Homo sapiens（人）”，標識符（Identifier）設置為“Official gene symbol（官方名稱）”，設定P<0.001（P值反映生物功能的顯著性及通路的富集程度，P值越小，則富集結果顯著性越高）。將通路P值由小到大排序，并將富集結果導入微生信在線作圖平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）中進行可視化展示。

1.6 活性成分-靶點-關鍵通路網絡構建

將前10條關鍵通路與菟絲子-枸杞子藥對的活性成分、潛在作用靶點相對應，并通過Cytoscape 3.7.0軟件構建活性成分-靶點-關鍵通路網絡，直觀地展現菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的復雜網絡關系，闡釋該藥對治療卵巢早衰的潛在作用機制。

2 結果

2.1 菟絲子-枸杞子藥對活性成分篩選結果

通過TCMSP數據庫檢索共獲得菟絲子活性成分10種、枸杞子活性成分35種，合并去重后共獲得活性成分42種，詳見表1。菟絲子作用靶點蛋白343個，枸杞子作用靶點蛋白364個，合并去重經Uniprot數據庫標準化后得到靶點蛋白231個。

2.2 卵巢早衰相關靶點檢索結果

從GeneCards數據庫共獲得卵巢早衰相關靶點基因3 830個，其Score最大值為201.03、最小值為0.24，中位數為4.39，故設定Score>4.39的靶點為卵巢早衰的潛在靶點，結合OMIM數據庫補充相關靶點信息，合并去重后最終獲得卵巢早衰疾病靶點1 913個。

2.3 主要活性成分-疾病靶點網絡的分析結果

共獲得菟絲子-枸杞子藥對活性成分靶點與卵巢早衰靶點的交集基因149個，韋恩圖見圖1。將上述交集基因導入Cytoscape 3.7.0軟件中，構建活性成分-卵巢早衰靶點網絡圖，詳見圖2。由圖2可見，該網絡含節點193個，其中藥材節點2個、活性成分節點42個、靶點節點149個，成分與靶點之間邊507條;活性成分平均節點度值為12.071 4，大于平均節點度值的活性成分有7個。其中，菟絲子和枸杞子共有活性成分槲皮素節點度值最大，為238，預測槲皮素為菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的主要活性成分;其次為山柰酚（菟絲子）、β-谷甾醇（菟絲子和枸杞子共有）、異鼠李素（菟絲子）、黃豆黃素（枸杞子）和豆甾醇（枸杞子）、芝麻素（菟絲子）。

2.4 菟絲子-枸杞子藥對活性成分與卵巢早衰交集基因PPI網絡的分析結果

菟絲子-枸杞子藥對活性成分與卵巢早衰交集基因的PPI網絡圖見圖3。由圖3可見，該網絡含節點149個與邊2 970條，平均節點度值為39.9，平均介數值為0.005 4。菟絲子-枸杞子藥對可能通過蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤抑制蛋白P53（TP53）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、白細胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、胱天蛋白酶3（CASP3）等關鍵靶點發揮治療卵巢早衰的作用。

2.5 交集基因的富集分析結果

將交集基因導入DAVID 生物信息學數據庫中進行GO分析，共得到GO條目247個（P<0.001），其中分子功能39個、生物過程185個、細胞組分23個，主要涉及蛋白結合、促進RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄等，且主要集中在細胞核，其中分子功能、生物過程、細胞組分富集基因數排序前10位的GO分析結果見表2～表4。KEGG通路富集分析共篩選出信號通路87條（P<0.001），主要涉及癌癥信號通路、乙型肝炎信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、叉頭框轉錄因子O亞族（FoxO）信號通路等，詳見圖4。

2.6 成分-靶點-關鍵通路網絡的分析結果

將關鍵通路與“菟絲子-枸杞子”藥對的活性成分、潛在作用靶點一一對應，構建活性成分-靶點-關鍵通路網絡，詳見圖5。由圖5可見，菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰涉及多個活性成分、靶點及通路。主要活性成分有菟絲子中的黃酮類及醇類，枸杞子中的黃酮類及醇類，主要靶點有AKT1、TP53、VEGFA、IL6、TNF、CASP3等，通路主要涉及癌癥信號通路、乙型肝炎信號通路、PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路等。

3 討論

菟絲子-枸杞子藥對是中醫臨床治療卵巢早衰的常用藥對，具有補腎填精、調節腎陰陽平衡的功效，是左歸丸、歸腎丸、五子衍宗丸的核心藥對[7，9]。現代藥理研究顯示，菟絲子的主要藥理作用包括增強免疫力、調節內分泌、營養神經、增加冠脈血流量、降血糖、抗氧化和抗衰老等[10]，枸杞子的主要藥理作用包括提高免疫力、抗氧化、抗衰老、保護神經、降壓、降血糖、抗腫瘤等[11]。菟絲子-枸杞子配伍的現代研究表明，二者配伍可以治療卵巢早衰、更年期綜合征、不孕不育等疾病[7]。陳雯玥等[12]利用中醫傳承輔助平臺對270個治療卵巢早衰方劑組方藥材的用藥頻次進行分析，結果菟絲子和枸杞子在處方中出現頻次分別位居3、4位，可見菟絲子和枸杞子在卵巢早衰臨床治療中具有重要意義。目前，菟絲子-枸杞子藥對配伍作用于卵巢早衰的藥理學研究報道較少，因此本研究對菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的潛在作用機制進行了深入分析。

3.1 菟絲子-枸杞子藥對活性成分與靶點分析

本研究共篩選出菟絲子-枸杞子藥對潛在活性化合物42個，其中部分化合物已通過研究證實其具有保護卵巢的作用。例如，王永霞等[13]研究表明，菟絲子總黃酮具有類雌激素樣活性，可以改善下丘腦-垂體促性腺功能和卵巢內分泌功能，促進卵泡發育，增加卵巢激素受體的數量，對改善模型大鼠的卵巢早衰有很好的效果。槲皮素能促進各級卵泡生長發育，增加顆粒細胞的雌激素分泌并促進其正常增殖，有效地改善卵巢功能[14]。β-谷甾醇具有雌激素樣活性，可促進卵巢顆粒細胞產生雌激素，對卵巢早衰致骨代謝失衡具有協同調節作用[15]。在活性成分-靶點網絡的構建中，菟絲子-枸杞子藥對活性成分中節點度值較高的化合物有槲皮素、異鼠李素、山柰酚、β-谷甾醇、芝麻素、黃豆黃素、豆甾醇等，表明這幾種化合物在保護卵巢功能中起著主要的作用，可能是菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的有效成分。但目前對于這幾種有效成分的相關作用機制尚不明確，有待進一步深入研究。通過PPI網絡的構建可以發現，菟絲子-枸杞子藥對可能通過AKT1、TP53、CASP3等關鍵靶點發揮治療卵巢早衰的作用，且結合GO富集分析、KEGG通路富集分析以及活性成分-靶點-關鍵通路網絡，發現靶點涉及多種生物過程和信號通路與卵巢早衰的發生發展關系密切。目前已有相關研究發現，AKT1是PI3K/AKT信號通路中重要的下游靶激酶，參與了細胞生長的調控，當AKT1正常表達時，可以維持原始卵泡正常的生長發育，可以調節卵母細胞的生長和顆粒細胞的增殖分化，并可抑制細胞凋亡;當AKT1表達異常時，則會使原始卵泡生長發育失常，導致卵巢發生病理性改變，從而加速卵巢衰老的進程[16]。TP53也與卵巢顆粒細胞的凋亡和增殖密切相關[17]。CASP3是CASP家族中的一個凋亡效應子，在卵母細胞、顆粒細胞中均有表達，主要參與細胞凋亡過程，當CASP3系統被激活時可觸發細胞凋亡，進而加速卵巢早衰[18]。可見，菟絲子-枸杞子藥對可能通過調節以上主要靶點而發揮治療卵巢早衰的作用。

3.2 菟絲子-枸杞子藥對GO生物過程分析

通過GO富集分析發現，菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰涉及多種分子功能、生物過程和細胞組分。生物過程主要涉及促進RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、信號轉導、氧化還原過程、炎癥反應、促進細胞增殖、凋亡過程等。其中，凋亡過程與卵巢早衰的發生發展密切相關，當卵母細胞DNA受到損傷時，下游信號分子促凋亡基因被激活，可誘發細胞凋亡級聯反應，直接或間接使卵巢儲備功能下降[19]。氧化還原過程也在卵巢早衰的發生發展中發揮了重要的作用，某些化療藥物可以使活性氧增加，可能是由PI3K/AKT等信號通路介導產生，活性氧不僅可通過激活卵泡凋亡信號、上調凋亡蛋白和下調抑凋亡蛋白表達、破壞細胞微管結構和染色體排列來降低卵母細胞的質量，加速卵母細胞老化，還可以對線粒體脂質、脫氧核糖核酸和蛋白質造成氧化損傷，當線粒體受損時，可以觸發線粒體自噬途徑，受損的線粒體向胞質釋放高水平的鈣和細胞色素C，最終引起顆粒細胞凋亡或死亡[20-21]。與卵巢早衰相關的微小RNA（miRNA）的上調與下調對卵巢早衰的形成具有一定的作用[22]，并逐漸成為潛在的治療靶點。在卵巢中miRNA的廣泛表達在卵泡成熟過程中具有重要的作用，已有實驗研究發現，西洋參能夠通過增加miR-29a和miR-144水平來調節前列腺素的生物合成，以調節排卵、預防卵巢衰老，從而保護卵巢功能[23]。此外，有研究表明，卵巢早衰患者中IL6等炎癥因子水平較高，可通過降低卵巢炎癥反應、降低血清中炎癥因子水平從而達到改善卵巢功能的目的[24-25]。以上均表明，菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰可能涉及了多種復雜的生物過程。

3.3 關鍵通路的相關機制分析

PI3K/AKT信號通路是卵巢早衰的重要通路之一，該通路與多種疾病發生有關，主要參與調節原始卵泡的發育、顆粒細胞的增殖分化、卵母細胞生長等過程，該通路中各信號分子表達異常會導致原始卵泡生長發育受限，阻礙顆粒細胞增殖分化，進而導致卵巢功能下降。FoxO信號通路為PI3K/AKT通路下游眾多通路中的一條，相關研究發現，PI3K表達上調并激活AKT時，可以促進FoxO3a磷酸化并喪失轉錄活性，導致原始卵泡池過度激活，使卵巢原始卵泡和初級卵泡減少、卵巢纖維化、髓質破壞和卵巢萎縮，從而降低卵巢儲備[26]。有研究表明，中藥復方新加歸腎丸可以通過增強PI3K/AKT信號通路的活性，從而促進卵泡的生長發育和顆粒細胞的增殖，抑制卵泡的過度閉鎖，修復卵巢功能[27]。PI3K/AKT下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）對卵泡的調節起重要作用，mTOR活化水平下降則會阻礙卵泡生長發育;此外，過度活化的mTOR也會加速原始卵泡顆粒細胞的分化，過早激活休眠卵母細胞和原始卵泡，導致卵泡池過度耗竭，從而加速卵巢早衰[28]。進一步驗證PI3K/AKT信號通路在卵巢早衰中具有重要意義。MAPK信號通路在卵泡生長、發育、成熟過程中有重要的調節作用[29]。Ras信號通路參與卵巢顆粒細胞的正常生長和增殖過程，間接影響卵母細胞的成熟，當通路中任一環節發生異常時，可以導致惡性腫瘤的發生[30]。TP53信號通路也是卵巢早衰發生發展的重要通路之一，TP53的一個同系物TAp63是DNA損傷凋亡通路的關鍵調控因子，當細胞DNA受損時，TAp63與磷酸化的非受體酪氨酸激酶c-Abl相互作用，激活下游信號分子促凋亡基因，誘發細胞凋亡級聯反應，直接或間接使卵巢儲備功能下降[31]。以上結果提示，菟絲子-枸杞子藥對可能通過調節上述代謝通路進而改善卵泡的生長發育、顆粒細胞的增殖分化和卵母細胞的生長過程，發揮治療卵巢早衰的作用。

4 結語

本研究通過檢索共獲得菟絲子-枸杞子藥對的活性成分42個，活性成分治療卵巢早衰的潛在作用靶點有149個。活性成分-靶點網絡直觀體現了該藥對通過多成分、多靶點治療卵巢早衰的特點;同時，靶點PPI網絡反映出該藥對治療卵巢早衰相關的各靶點之間聯系緊密;通過GO富集分析和KEGG通路富集分析發現，菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰涉及多種細胞生物過程和信號通路。以上均表明菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的作用機制較為復雜，涉及多個活性成分、作用靶點及生物通路。本研究對藥物治療作用的潛在分子機制進行了初步探討，為進一步實驗研究奠定了基礎。但考慮到兩味中藥組合一起在煎煮時可能會發生復雜的化學反應，本研究忽略了菟絲子-枸杞子藥對煎煮后的化學成分及藥材中各成分的含量，故具有一定的局限性，其具體作用機制還需后續實驗研究加以驗證。同時，除現有相關研究報道的活性成分外，本研究還發現了菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的其他潛在活性成分（芝麻素、豆甾醇等）以及靶點（IL6、TNF等），為卵巢疾病后續治療及新藥研發提供了參考。

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（收稿日期：2020-06-08 修回日期：2020-08-02

（編輯：鄒麗娟）