miRNA-33a對馬拉松跑導致心肌纖維化的調控作用

徐承建 祝捷

摘? ? 要：目的：通過動物實驗建模和細胞學實驗驗證miRNA-33a對馬拉松跑導致心肌纖維化的調控作用。方法：通過動物實驗建模對實驗大鼠進行馬拉松跑訓練，檢測miRNA-33a的變化情況及心肌形態學差異，以分析實驗大鼠左心室心肌纖維化對心功能的影響程度。通過細胞學實驗證明miRNA-33a對CFb合成膠原蛋白、分化等的調控作用。 結果：1）檢測各組大鼠的心功能狀況：相比對照組（CG），實驗組（EG）大鼠的左心室射血分數（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS） 均顯著下降 （P<0.05）;而相比實驗組（EG），miRNA-33a +EG組大鼠的LVEF顯著提高、LVFS顯著增長。2）Q-PCR檢測顯示：與對照組（CG）相比，實驗組（EG）的miRNA-33a顯著上調（P<0.05）;與實驗組（EG）相比，miRNA-33a +EG組的miRNA-33a則顯著下降（P<0.05）。3）HE染色結果顯示：miRNA-33a +EG的大鼠心肌纖維結構紊亂得到緩解，且肌細胞體積明顯縮小。Masson染色結果顯示：miRNA-33a +EG的大鼠膠原纖維數量顯著減少，心肌纖維結構排列相對有序。與實驗組（EG）相比，miRNA-33a +EG膠原蛋白容積分數顯著下降（P<0.05）。4）Western blot檢測結果顯示：轉染miRNA-33a 模擬物后，CFb細胞I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、CTGF的蛋白含量均顯著增加（P<0.05）;轉染miRNA-33a 抑制劑后，CFb細胞I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、CTGF的蛋白含量均顯著減少（P<0.05）。5）Western blot檢測結果顯示：miRNA-33a 模擬物顯著增加CFb細胞a-SMA的蛋白含量（P<0.05）; miRNA-33a 抑制劑顯著降低CFb細胞a-SMA的蛋白含量（P<0.05）。結論：miRNA-33a可顯著改善馬拉松跑導致心肌纖維化的病理變化，為后續研究提供了干預靶點。

關鍵詞：miRNA-33a;馬拉松;心肌纖維化;心臟成纖維細胞

中圖分類號：G 804.5? ? ? ? ? 學科代碼：040302? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Objective： To verify the regulation of miRNA-33a on myocardial fibrosis resulted from marathon through animal and cytological experiments. Methods： The variation of miRNA-33a in the left ventricle and the morphology of myocardial morphology is to be verified by zoological experiments， so as to analyze the degree of left ventricular fibrosis in rats. Through cytological experiments， it is to prove that miRNA-33a regulates the function of CFb synthesis of collagen and differentiation in the cytological layer. Results： 1） Determination of cardiac function in each group： Compared with control group（CG）， the left ventricular ejection fraction （LVEF） and left ventricular short axis shortening rate（LVFS） of EG group were significantly lower（P<0.05） in the experimental group（EG）; LVEF and LVFS in the miRNA-33a antago-miR+EG group were significantly increased in EG. 2） Q-PCR showed that the expression of miRNA-33a was significantly up-regulated in EG compared with CG（P<0.05）. Compared with EG， miRNA-33a antago the expression of miRNA-33a in the -miR+EG decreased significantly（P<0.05）. 3） HE staining showed that the disorder of tissue structure arrangement in miRNA-33a antago-miR+EG was alleviated， and the myocyte volume was significantly reduced. Masson staining showed that the number of collagen fibers in miRNA-33a antago-miR+EG was significantly decreased. The muscle fibers are arranged in a relatively orderly manner. Compared with EG， the collagen volume integral of the miRNA-33a antago-miR+EG significantly decreased（P<0.05）. 4） Western blot analysis showed that transfection of miRNA-33a mimics increased the expression/content of type I， type III collagen and CTGF in CFb cells at mRNA/protein level （P<0.05）; transfection of miRNA-33a inhibitor The expression/content of type I， type III collagen and CTGF decreased at the mRNA/protein level（P<0.05）. 5. Western blot analysis showed that miRNA-33a mimics significantly increased a-SMA protein content in CFb cells（P<0.05）. Transfection of miRNA-33a inhibitor significantly decreased a-SMA protein content in CFb cells（P<0.05）. Conclusion： miRNA-33a can significantly improve the pathological process of myocardial fibrosis resulted from marathon. It provides a good target for intervention for subsequent research.

Keywords：miRNA-33a; marathon; myocardial fibrosis; cardiac fibroblasts

近年來，因馬拉松跑引發運動損傷甚至猝死的案例逐年增加，這引發了研究者對馬拉松跑及長跑訓練對心臟是否會造成病理性損傷的質疑[1-3]。自2011年有研究提出各類耐力性運動可能會造成心肌纖維化（簡稱“MF”）損傷以來，近年又有研究顯示，以馬拉松為典型的長期大強度耐力訓練可誘發MF，馬拉松運動員的MF發生率顯著高于一般人[2，4]。還有研究顯示：MF是多種心血管疾病的病理生理基礎，譬如心肌病、高血壓、惡性心律失常和心功能不全等[5]。MF的發生與心肌炎癥反應、心肌細胞凋亡和自噬等均有關[6-7]。例如，馬拉松的大強度運動訓練，可能促使機體因細胞因子活化等，激活上述機制，導致心臟成纖維細胞（簡稱“CFb”）分化為心臟肌成纖維細胞（簡稱“CMF”），這種肌成纖維細胞的繁殖活性和膠原蛋白合成能力比靜息狀態下的CFb顯著增強，膠原蛋白過度堆積，即可導致心肌纖維化的發生[5，8]，但具體作用機制有待深入開展運動性心肌纖維化的病理研究予以明確。

微小核糖核酸（miRNA）是內源性的非編碼RNA，通過識別并結合在其基因3-末端未翻譯區的互補序列，從而在轉錄后水平上抑制該基因的變化。miRNA參與多種生物功能過程，譬如細胞繁殖、分化和死亡、機體新陳代謝、血管生成等，是重要的基因表達調控過程之一。由此可見，研究miRNA參與心肌纖維化的病理生理過程可為干預馬拉松所致MF提供理論參考。目前已發現多種miRNA參與調控心肌纖維化過程，諸如miRNA-21、miRNA-45可以促進心肌纖維化的發生，而miRNA-24、miRNA-29、miRNA-101和miRNA-133a可抑制心肌纖維化的發生[9-11]。其中，miRNA-33a在CFb中表達多樣，有研究發現其與高密度脂蛋白膽固醇的代謝相關，抑制miRNA-33a可抑制線粒體呼吸過程和ATP產生，且能促使ABCA1變化，從而能抑制巨噬細胞膽固醇外流，抑制動脈粥樣硬化的形成，由此推斷，miRNA-33a可能是潛在的馬拉松所致MF的干預靶點[12]。

本研究通過動物學及細胞學實驗探討miRNA-33a對馬拉松跑所致心肌纖維化的調控作用，以期明確miRNA-33a在其中的作用機制。

1? ?實驗器材及方法

1.1? 實驗動物

選取SPF級雄性SD大鼠50只，由南方醫科大學動物實驗中心提供（質量合格證編號：11651301251428）。大鼠飼養于南方醫科大學中心實驗室，飼養環境為清潔級，溫度維持在20 ～22 ℃。分籠飼養，每籠2只，每周換墊料、消毒籠具2次，飼養至體質量為220 ～250 g時備用。

1.2? 實驗儀器及耗材

實驗儀器及耗材包括：超凈工作臺、酶標儀、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、恒溫水浴鍋、水平離心機、低溫高速離心機、渦旋混勻器、眼科剪、眼科鑷、磁力攪拌器、PH計、純水儀、陶瓷研磨器、western blot電泳儀、電轉儀、western blot電泳槽及電轉夾、水平搖床、成像儀、稱量天平、超聲破碎儀、紫外檢測儀、制冰機、PCR儀、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱等。

1.3? 實驗建模

適應性飼養大鼠1 周后開始進行馬拉松跑適應性訓練。馬拉松跑的條件：封閉小動物平板跑臺儀，跑道長為340 mm、寬為135 mm，并外罩有機玻璃，主動軸與驅動電機相連。依據Bedford[13]研制的大鼠跑臺運動負荷等級表，設為5級運動負荷，每級速度分別為8 m/min、16 m/min、20 m/min、24 m/min、27 m/min，每級跑道傾角分別為0 °、5 °、10 °、10 °、10 °，在1 min內勻速遞增至下一級，直至第5級。通過每天45 min跑臺適應性訓練后剔除不適應大鼠。將剩余大鼠依照隨機數字表法分為3組：對照組（簡稱“CG”）、實驗組（簡稱“EG”）、miRNA-33a拮抗劑注射實驗組（簡稱“miRNA-33a+EG”）。

CG大鼠正常飼養不予任何處理，并傳代CG的心臟成纖維細胞進行后續細胞學實驗;EG大鼠于平板跑臺儀進行馬拉松跑模擬訓練6周，于大鼠力竭時取出休息10 min后恢復訓練，確保每日分次訓練時間之和不少于120 min;miRNA-33a antago-miR+EG大鼠則于訓練前3天根據大鼠的體質量，將200 pMoL/kg的miRNA-33a antago-miR稀釋于1 mL滅菌PBS溶液，予大鼠以尾靜脈注射，連續3天后開始進行馬拉松跑訓練，訓練方案同EG。

1.4? 超聲心動儀

馬拉松跑訓練6周后用超聲心動儀檢查各組大鼠的心功能狀況：通過腹腔注射戊巴比妥鈉溶液誘導麻醉，誘導麻醉成功的表征為呼吸頻率變慢、四肢緊張度降低、夾趾反應陰性。之后，仰臥位固定大鼠，大鼠左前胸部皮膚涂抹耦合劑，固定超聲探頭后進行M型和B型超聲檢查，分別采集圖像3次。超聲檢查過程中要注意大鼠的呼吸頻率和心率，避免過度按壓探頭引起呼吸、心跳驟停。本論文的檢測指標主要包括左心室射血分數（簡稱“LVEF”）和左心室短軸縮短率（簡稱“LVFS”），以分析馬拉松跑導致心肌纖維化對心功能的影響程度。

1.5? 病理組織學染色

超聲檢查結束后，對各組大鼠進行心臟取材。使用Q-PCR檢測各組大鼠左心室心肌miRNA-33a的變化情況。使用石蠟包埋、切片之后，使用HE染色觀察各組大鼠左心室各類心肌細胞的形態差異，使用Masson染色觀察各組大鼠左心室各類纖維的形態差異。

1.6? 細胞學實驗

本研究的細胞學實驗分為4組：空白對照組（簡稱“BCG”）、陰性對照組（簡稱“NCG”）、miRNA-33a模擬物轉染組、miRNA-33a抑制劑轉染組。

傳代CG大鼠的CFb進行細胞學實驗。轉染前一日采用6孔板對消化細胞進行接種，細胞數量為2×105孔，細胞培養基為1 500 μL。次日，當細胞融合度達50%～70%時再進行轉染。用250 μL無血清OPti-MEM培養基分別稀釋5 μL miRNA-33a的模擬物和抑制劑，緩慢混勻，在室溫下孵化5 min。用250 μL無血清OPti-MEM培養基稀釋4 μL脂質體Lipofectamin 2000，緩慢混勻，在室溫下孵化5 min。將稀釋的miRNA-33a 的模擬物和抑制劑分別與Lipofectamin 2000充分混勻，混合液置于室溫下孵化20 min，將混合液倒入含有1 500 μL細胞培養基的培養孔中，緩慢混勻。靜置于37 ℃的二氧化碳培養箱內，每隔4～6 h換溶液，miRNA-33a 的模擬物和抑制劑的最大濃度應為50 Nm，在轉染48～72 h后進行實驗。

使用Q-PCR檢測各組細胞miRNA-33a的變化;然后使用Q-PCR、Western blot檢測膠原蛋白的主要成分，即Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）及其編碼蛋白Col1A1/Col3A1的差異，另檢測促CFb細胞活化并合成膠原蛋白的結締組織生長因子（簡稱“CTGF”）的差異;使用Western blot檢測肌動蛋白-α（簡稱“a-SMA”）的變化以明確CFb細胞分化為CMF的情況。

1.7? 統計學方法

應用Excel 2016軟件建立數據庫，使用雙次錄入法以完成數據核對與邏輯糾錯?；赟PSS21.0軟件完成數據處理，設定雙側P<0.05為差異具有統計學意義。對計量數據進行Kolmogorov-Smirnov檢驗：符合正態分布的計量數據表示為均數±標準差（Mean±SD/SEM），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法;不符合正態分布的計量數據以中位數及四分位數表示，兩組間及多組間比較采用秩和檢驗。

2? ?研究結果

2.1? 實驗建模

剔除未通過適應性訓練的4只大鼠，剩余大鼠被隨機分入3組，其中：CG為18只、EG及miRNA-33a+EG分別為14只，在實驗建模6周后完成實驗。

2.2? 超聲心動檢測結果

各組大鼠的心功能狀況：相比CG大鼠，EG大鼠的LVEF及LVFS均顯著下降（P<0.05）;相比EG大鼠，miRNA-33a+EG大鼠LVEF及LVFS均顯著提高（P<0.05），如圖1所示。

2.3? 心肌組織病理組織學分析結果

與EG大鼠相比，miRNA-33a+EG大鼠的心肌纖維結構紊亂得到緩解，且肌細胞體積明顯縮小。使用Masson染色觀察各組大鼠左心室各類肌纖維的形態差異：與EG相比，miRNA-33a +EG膠原纖維數量顯著減少，心肌纖維排列相對有序。進一步使用IPP6.0分析Masson染色結果顯示：與EG相比，miRNA-33a +EG膠原容積分數顯著減少（P<0.05）。如圖2所示。

2.4? 細胞學實驗結果

分離、傳代、轉染CFb細胞之后，Q-PCR檢測結果顯示：轉染miRNA-33a模擬物能顯著上調CFb細胞的miRNA-33a水平（P<0.05），轉染miRNA-33a抑制劑則顯著下調CFb細胞的miRNA-33a水平（P<0.05）。這說明細胞學模型造模成功。基于細胞學模型進一步檢測得出如下結果：1）使用Q-PCR檢測各組Col1A1、Col3A1及其CTGF的mRNA的水平。相比BCG和NCG，轉染miRNA-33a模擬物后，上述指標的mRNA均顯著增長（P<0.05）;相比BCG和NCG，轉染miRNA-33a抑制劑后，上述指標的mRNA均顯著減少（P<0.05），如圖3所示。2）使用western-blot檢測各組CollagenⅠ、CollagenⅢ及其CTGF的蛋白含量，其結果與mRNA變化規律一致，即：相比BCG和NCG，轉染miRNA-33a模擬物后，上述指標的蛋白含量均顯著增加（P<0.05）;相比BCG和NCG，轉染miRNA-33a抑制劑后，上述指標的蛋白含量均顯著減少（P<0.05），如圖4所示。3）相比BCG和NCG，miRNA-33a模擬物轉染組的CFb細胞的α-SMA顯著增加（P<0.05）;相比BCG和NCG，miRNA-33a抑制劑可在蛋白水平抑制CFb細胞的α-SMA顯著減少（P<0.05），如圖5所示。

3? ?討論

在進行馬拉松跑時，缺氧等可導致心肌組織中各種膠原纖維蛋白堆積、Ⅰ型膠原蛋白纖維、Ⅲ型膠原蛋白纖維的比例嚴重失調，心室壁僵硬度增加、心室壁運動功能逐漸失調、心室順應性降低，在早期可引起舒張功能障礙，逐漸地可導致心室收縮功能減弱，從而引起心肌纖維化、惡性心力衰竭的發生。

隨著CFb大量分化為CMF，其繁殖能力顯著增強，分泌合成Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、CTGF等的能力顯著提高，顯著加速了馬拉松跑所致心肌纖維化的發生，因此，尋找到能夠抑制CFb繁殖、合成膠原蛋白、分化的靶點，對延緩或抑制馬拉松跑導致的心肌纖維化的病變過程，具有十分重要的臨床意義。

目前，有研究發現，多種miRNA參與調控心肌纖維化過程，諸如miRNA-21可以促使心肌纖維化的發生，而miRNA-24、miRNA-29、miRNA-101和miRNA-133a可抑制心肌纖維化的發生[14]。由此可見，研究miRNA參與心肌纖維化的病理生理過程可為臨床干預心肌纖維化確定新的治療方案。另有研究顯示：miRNA-33a在心臟成纖維細胞中變化多樣，與高密度脂蛋白膽固醇的代謝相關，抑制miRNA-33a的變化可抑制線粒體呼吸過程和ATP產生，且能增加ABCA1的表達，從而能抑制巨噬細胞膽固醇外流，抑制動脈粥樣硬化的形成，由此可見，miRNA-33a可能是一個潛在的心血管疾病的干預靶點[15-16]。然而，miRNA-33a對于馬拉松跑所致MF的影響尚未見有研究。

鑒于此，本研究進行了動物實驗和細胞學實驗，試圖初步探討miRNA-33a對于馬拉松跑所致MF的調控機制：在動物學實驗中，拮抗劑miRNA-33a顯著改善馬拉松跑導致心肌纖維化大鼠的心功能，并緩解心肌組織的病理學變化;細胞學實驗進一步證實，miRNA-33a具有增強CFb細胞分泌膠原蛋白的能力，并能促進CFb細胞分化為CMF細胞，以進一步加速MF進程;抑制miRNA-33a變化可以在細胞學實驗中得到相應的反向結果。該結果顯示，miRNA-33a通過影響CFb細胞分化，促進其合成膠原蛋白，從而加快馬拉松跑導致心肌纖維化的進程，構成后續心血管疾病的病理生理基礎。

4? ?結論

通過建立馬拉松跑訓練的動物實驗模型，研究結果顯示，長期大強度的馬拉松跑訓練可導致心肌纖維化。從miRNA-33a這一作用靶點探討其中的病理生理機制，為進一步揭示馬拉松跑所致MF的發生機制、預防機制、干預途徑奠定了一定的理論基礎。后續有必要深入開展運動性心肌纖維化病理與發病機制研究。

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