血管過氧化物酶1對心肌梗死后心肌纖維化機制的影響

朱 勇，李吉明，高冉冉，楊建中

0 引言

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)后發生的心室重構包括心室重量、形態變化和容積增加等，其中以心肌細胞肥大與心肌組織纖維化為心室重構發生病變的主要特征表現[1]。而抑制心肌梗死后心肌組織纖維化過程是治療心肌梗死的一個重要靶點。成纖維細胞是導致心肌纖維化的重要效應細胞[2-4]，在心肌梗死過程中，大量成纖維細胞增殖分化活性增高，代償性修繕心肌梗死部位，但此現象可能會使心臟喪失心肌順應性從而導致心肌纖維化[5-7]。心肌纖維化會使心肌僵硬度逐步增加，心室舒張功能逐步減退，引起左心室擴張和心力衰竭，誘發惡性心律失常，甚至猝死。另外，成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化是心肌纖維化發展的關鍵過程[5]，肌成纖維細胞大量表達α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，其具有更強的收縮能力及分泌能力，這與心肌纖維化等病理損傷密切相關[8-9]。同時，大量文獻已證實,成纖維細胞或肌成纖維細胞可以通過分泌一些可溶因子來調控心肌細胞的結構及功能，進而調控心肌細胞的生理功能[10-13]。

血管過氧化物酶1(Vascular peroxidase 1，VPO1)是一種主要存在于心血管系統中的含有血紅素的過氧化物酶。VPO1類似于髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)，能將過氧化氫(H2O2)催化成為氧化性更強的次氯酸(HOCl)，從而促進機體細胞損傷[14]。VPO1主要在血管內皮細胞、平滑肌細胞和心肌細胞中表達，在調節心血管疾病的發展中起著重要的信號傳導作用[15-17]。有研究表明，VPO1 在血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖中起著重要作用[18]。

目前，MI后心肌纖維化的發病機制尚未完全明確，心肌纖維化發生與發展過程中有許多細胞和分子參與，調控機制受許多因素的影響，形成機制較為復雜。本實驗探究了MI后VPO1對心肌纖維化機制的影響，通過特異性沉默VPO1 的表達，研究其對心肌成纖維細胞增殖分化以及心肌纖維化標志物Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)合成的影響，為臨床治療心肌纖維化提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級成年雄性SD大鼠，鼠齡7周左右，體重180～220 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SYXK(新)20170006。主要試劑：免疫組織化學檢測試劑盒(PV 6000G)、細胞計數試劑盒(CCK-8)和Masson 染色試劑盒購自日本Dojindo公司，siRNA 與NC siRNA購自上海吉瑪生物有限公司，青霉素、鏈霉素、60%胰蛋白酶/EDTA和40%膠原酶Ⅱ購于美國 Sigma 公司，兔抗α-SMA、兔抗VPO1、山羊抗兔IgG、抗Ki67和抗 Collagen Ⅰ抗體均購于美國Millipore公司，抗GAPDH和抗3-Cl Tyr抗體購于荷蘭Hycult Biotech公司等。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 將40只SD大鼠隨機分為2組：假手術組(sham組，10只)和模型組(30只)，制作大鼠心肌梗死模型，用2%異氟烷將大鼠麻醉，仰臥固定、胸部備皮，于胸骨左側第4、5肋間開胸，剪開心包，暴露心臟，在距左冠狀動脈起點處 2～3 mm用手術線結扎冠狀動脈左前降支，關閉胸腔，縫合胸壁。sham組大鼠只做手術不結扎冠狀動脈。術后每只大鼠注射40 000 U/d 的青霉素，防止傷口感染。術后7 d內，模型組有3只大鼠死亡，假手術組無大鼠死亡，檢測兩組大鼠的心臟超聲情況以及左心室組織結構及功能狀態的變化。分別在MI后第7、14、28天，隨機選擇6只大鼠，取其心臟組織進行實驗。

1.2.2 Masson 染色 心臟組織用4%多聚甲醛固定，修剪包埋，浸于梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片(厚度約為4 μm)。石蠟切片脫蠟至水后，用weigert氏蘇木溶液處理10 min，1%鹽酸乙醇分化1 min，蒸餾水沖洗25 min，麗春紅酸性品紅液染色10 min，l%磷鉬酸水溶液分化5 min，2%亮綠染液染色5 min，1%冰醋酸水溶液浸洗1 min。隨后分別用95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察并進行圖像采集及分析。

1.2.3 免疫熒光染色 將心臟組織在OCT化合物中冷凍并切成8 μm的縱切片。將切片解凍，用4%甲醛溶液固定20 min，并用0.2%Triton X-100透化20 min。用10%山羊血清室溫封閉30 min，并分別與兔抗α-SMA (1∶200)、兔抗VPO1 (1∶50)和兔抗MPO (1∶50)抗體在4 ℃下孵育過夜。加入TRITC 標記的山羊抗兔IgG (1∶200)作為二抗，在室溫下孵育2 h。細胞核用DAPI染色10 min后封片。使用熒光顯微鏡觀察并進行圖像采集、分析。

1.2.4 免疫組織化學染色 將石蠟切片脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，3% H2O2+甲醇溶液去除內源性過氧化物酶，分別加抗3-Cl Tyr (1∶100)和抗Ki67 (1∶200)為第一抗體，4 ℃過夜。PBS沖洗3 min，沖洗3次。加二抗，室溫孵育10～15 min。PBS沖洗3 min，沖洗2次，DAB顯色。經復染，脫水，透明，封片，在電子顯微鏡下觀察，進行圖像采集與分析。

1.2.5 心肌成纖維細胞的分離和培養 將左心室剪碎，用60%胰蛋白酶/EDTA和40%膠原酶II在37 ℃下消化。將細胞懸浮液離心，重懸于含15%胎牛血清-100 U/ml青霉素-100 μg/ml 鏈霉素的DMEM溶液中，并在37 ℃、5%CO2的標準培養條件下培養，使成纖維細胞附著在培養板上，第1～3代用于實驗。

1.2.6 Western blot實驗 RIPA 裂解緩沖液提取培養的心肌成纖維細胞總蛋白，BCA法進行蛋白濃度測定，電泳。SDS-PAGE電泳分離蛋白，切膠并轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入抗VPO1 (1∶1 000)，抗α-SMA (1∶1 000)，抗3-Cl Tyr (1∶500)，抗GAPDH (1∶5 000)，抗Collagen I (1∶1 000)抗體，在4 ℃下過夜。TBST 漂洗 PVDF膜3次，10 min/次，將PVDF膜與HRP標記的二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，滴ECL發光液進行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質灰度值。

1.2.7 siRNA沉默VPO1 將24只健康SD大鼠隨機分為2組：siRNA組、NC siRNA組，每組12只。造模的前1周給兩組大鼠分別靜脈注射VPO1小干擾RNA(siRNA)或陰性對照(NC siRNA)，1周3次。將siRNA組隨機分為2組：si-VPO1 MI組、si-VPO1 sham組，每組6只。si-VPO1 MI組進行冠狀動脈結扎手術，si-VPO1 sham組大鼠不結扎冠狀動脈，其他操作均與MI組相同。術后接著對大鼠注射si-VPO1或NC siRNA，每周3次，持續到第28天。將NC siRNA組隨機分為NC siRNA MI組和NC siRNA sham組，除在術后給大鼠注射NC siRNA外，其他操作步驟均與siRNA組相同。所有大鼠均在第28天取心臟組織進行后續的Western blot、Masson染色以及細胞增殖分化實驗。

1.2.8 CCK8 檢測細胞增殖 收集siRNA或NC siRNA處理后，分離培養至對數生長期的心肌成纖維細胞，用 0.5%胰酶消化1～2 min后，用含10%FBS培養基重懸。在96孔板中加100 μl細胞懸液，在37 ℃、5% CO2培養箱里培養24 h。各孔加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，在酶標儀上450 nm處檢測吸光光度值。

2 結果

2.1 MI后心肌纖維化期間VPO1表達上調 與假手術大鼠相比，MI組大鼠左心室收縮壓降低，左心室壓力最大變化速率減小，左室末期舒張壓升高，心功能明顯降低，說明MI形成穩定，MI大鼠模型建立成功。

通過進一步Masson染色觀察發現，sham組心肌細胞排列整齊，細胞間質略有少量膠原纖維，而MI組殘留心肌細胞數目少，肥大細胞排列紊亂，部分心肌纖維溶解或斷裂，且隨著MI后時間推移，藍色膠原纖維也隨之增加。見圖1。

圖1 各處理組大鼠心肌梗死區的Masson染色結果(比例尺：50 μm)

經MI處理后，第7、14、28天，MPO和VPO1的免疫熒光為紅色，α-SMA的免疫熒光為綠色，且VPO1和α-SMA在心肌梗死的纖維化區域共定位。另外，MPO在MI后第7天熒光很亮，但第14天熒光較弱，到第28天時免疫熒光染色結果與sham 組相比無顯著差異。見圖2。

圖2 各處理組大鼠心肌梗死區的熒光染色結果(比例尺：50 μm)

Western blot結果顯示，與sham組相比，在MI后第14天和第28天，VPO1表達逐漸增加(P<0.01)，α-SMA和Collagen I的表達顯著升高(P<0.01)。與sham組相比，在MI第7天MPO的表達增加2倍，但第14天開始下降，第28天與sham組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖3A、B)。結合免疫熒光染色結果和Western blot結果推測，VPO1可能在心肌梗死后的心肌纖維化階段比MPO發揮更為重要的作用。

圖3 Western blot檢測各處理組的心臟組織中蛋白水平

免疫組化染色后發現，與sham組相比，MI組均有大量棕褐色著色細胞的表達(圖4A)。3-Cl Tyr 在MI后第7天，表達水平顯著增加(P<0.01)，在第14天和第28天略有下降，但與sham組相比表達仍上升(P<0.05)。MI后，在第7天及第28天，Ki67陽性細胞表達量增加(P<0.01)，且均高于sham組(圖4B)。由此可見，3-Cl Tyr和Ki67表達的研究結果與VPO1的結果相一致，推測VPO1可能通過調節心臟成纖維細胞分化、膠原蛋白I合成和細胞增殖來介導心臟纖維化的發展。

2.2 si-VPO1抑制心肌纖維化 為了進一步闡明VPO1在心肌纖維化中的功能作用，使用si-VPO1來沉默VPO1。Western blot結果顯示，在MI第28天，與注射si-NC相比，si-VPO1處理后顯著抑制VPO1的表達(P<0.01)(圖5A)。與si-NC組(13/24，54.2%)相比，si-VPO1組大鼠存活比例較高(14/19，73.6%)(P<0.05)(圖5B)。

Masson染色發現，si-VPO1處理的MI組整體膠原沉積少于si-NC處理的MI組(P<0.01)(圖6)。

2.3 VPO1在體內誘導心臟成纖維細胞分化和增殖 為了確定VPO1是否是心肌成纖維細胞分化所必需的物質，在 siRNA沉默VPO1實驗中分析纖維化標志物。MI后第28天，與si-NC sham組相比，si-NC處理的MI大鼠心臟組織的VPO1、α-SMA、Collagen Ⅰ表達上調(P<0.01)。然而，與si-NC MI相比，用si-VPO1處理MI大鼠后，VPO1、α-SMA、Collagen I的表達被顯著抑制(P<0.05或P<0.01)，說明si-VPO1可能阻斷了MI對VPO1、CollagenⅠ、α-SMA的誘導。見圖7。

圖4 各處理組3-Cl Tyr和Ki67的免疫組化染色水平(比例尺：3-Cl Tyr 50 μm，Ki67 20 μm)

圖5 Western blot檢測si-VPO1對VPO1表達及大鼠存活率的影響

圖6 si-NC和si-VPO1處理后Masson染色結果(圖6A比例尺：上部1 mm，下部100 μm)

心肌成纖維細胞的增殖是心臟纖維化的發病機制所必需的。MI后第28天，與si-NC sham組相比，si-NC MI組心臟中觀察到Ki67陽性細胞顯著增加(P<0.01)；而si-NC MI組與si-VPO1 MI組相比，si-VPO1 MI處理中Ki67陽性細胞顯著減少(P<0.01)(圖 8)。結果表明，VPO1可能在體內心肌成纖維細胞的分化和增殖中起重要作用。

圖7 Western blot檢測注射si-NC和si-VPO1后心肌組織中VPO1、Collagen I和α-SMA的蛋白表達

圖8 si-NC和si-VPO1處理后心肌組織中Ki67的免疫組化染色結果(圖8A比例尺：上部50 μm，下部20 μm)

3 討論

心肌纖維化是多種心臟疾病發展到一定階段的共同病變現象，也是MI后心臟重塑的最重要機制[19-20]，抑制心肌纖維化有利于心梗后的心室重構[21]。MI后心肌纖維化的發展是一種級聯反應，伴隨著成纖維細胞分化、增殖、遷移和沉積膠原蛋白等現象。MPO是一種由活化的中性粒細胞和巨噬細胞釋放的酶，是一種經過充分研究的過氧化物酶家族成員，產生的HOC1調節心肌梗死后的心臟重塑[22]。同樣，VPO1是一種新發現的過氧化物酶家族成員，在心血管系統中高度表達。此外，VPO1可以調節腎纖維化[23]。有研究表明，通過構建小鼠缺血再灌注模型后，VPO1誘導心肌細胞凋亡，而其抑制劑改善了這種現象[24]。本實驗發現，在MI的大鼠模型中，VPO1在缺血期間表達逐漸增加，并且隨著心肌纖維化程度的加重而增加。在MI的大鼠模型中，VPO1表達顯著上調的同時，成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的標志物α-SMA和心肌纖維化標志物Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)的表達也逐漸上升。在促進心肌纖維化的途徑中，心肌成纖維細胞的增殖也是一個重要機制[25-26]，Ki67為細胞增殖的一種標記，在細胞凋亡中的S、G2、M期均有表達。本研究中，MI后缺血期間Ki67陽性細胞的數量也在不斷增加。

由MPO產生的HOCl會增加左心室擴張并在MI后嚴重影響心臟功能[22]。有研究表明，MPO表達水平僅在MI后5～7 d達到峰值，隨后在沒有其他炎癥反應的情況下降低[27]。本研究顯示，MI后第7天MPO表達增加，隨后逐漸降低至與sham組相似的水平。然而，在MI的持續時間內，VPO1表達逐漸上調，第28天仍在上升。3-氯酪氨酸(3-Cl Tyr)是VPO1和MPO產生HOCl的特異性標志物。與sham組相比，MI后第7天，3-Cl Tyr水平顯著增加，并且在MI后28 d仍然升高。3-Cl Tyr的升高可能是由于高水平的VPO1表達。因此，推測VPO1可能是心肌纖維化形成和成熟階段的主要調節因素。

本研究顯示，VPO1抑制表達顯著減弱了心肌纖維化的程度，大鼠在MI后28 d的存活率顯著提高，表明VPO1可被鑒定為MI后心臟重塑和纖維化的關鍵調節因子。VPO1表達的降低減弱了MI后的心臟纖維化發展，這意味著VPO1可能是潛在的治療靶點。另外，在抑制VPO1的表達后，心肌成纖維細胞分化和膠原蛋白I沉積也被抑制，并阻止了心肌梗死后心肌纖維化大鼠模型中Ki67陽性細胞數量的增加。

本研究初次證明了VPO1在MI后對心肌纖維化機制的影響。VPO1可能通過調節心肌成纖維細胞分化、膠原蛋白I型合成和細胞增殖來介導心肌纖維化的發展。但VPO1具體參與的作用通路有待進一步探明。此外，VPO1是否可能是MI患者的預后標志物仍然未知，因此，需要進一步研究VPO1作為心臟纖維化生物標志物的臨床價值。