土槿乙酸誘導的卵巢癌細胞HO-8910自噬及其機制

王佳賀,王 楠,苑莉莉

0 引言

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，對女性的生命健康構成了嚴重的危害[1-3]。近年研究發現，許多中藥的有效成分通過調控腫瘤細胞自噬相關蛋白誘導腫瘤細胞自噬[4-7]。因此，探討中藥有效成分誘導腫瘤細胞自噬的分子機制對于卵巢癌的治療具有重要的臨床意義。土槿乙酸 (Pseudolaric acid-B，PAB)是由松科植物金錢松的根皮(土槿皮，又稱土荊皮)及近根皮提取的二萜類化合物。PAB通過抑制腫瘤細胞黏附和遷移、促進腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成等發揮抗腫瘤作用[8-9]。但關于土槿乙酸能否誘導卵巢癌細胞自噬及相關機制的研究鮮有報道。

因此，本研究在前期實驗的基礎上，通過體外實驗觀察土槿乙酸是否能夠誘導卵巢癌HO-8910細胞自噬和PI3K/Akt通路相關蛋白的變化，以及自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)及自噬激動劑雷帕霉素(RAPA)是否能夠影響土槿乙酸所致的卵巢癌HO-8910細胞自噬蛋白的表達，初步探討土槿乙酸誘導HO-8910細胞自噬及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640 培養基、胎牛血清購自Gibco 公司，3-MA 和RAPA為Sigma 公司產品，自噬相關抗體LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、β-actin及其他試劑均購于武漢博士德生物工程公司；流式細胞儀購自美國Backman公司；HO-8910 細胞購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 細胞培養 將HO-8910 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在培養箱中孵育(37 ℃，5%CO2)，當貼壁細胞生長到90%時，應用0.25%胰酶進行消化，再用0.02%EDTA處理細胞，以備進行細胞實驗。

1.3 細胞處理 將細胞置于培養皿中，當貼壁細胞增長到70%～90%時，移除培養液，應用PBS清洗2次，將不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)加入HO-8910細胞培養液中分別培養0、6、12、24 h。

1.4 臺盼藍染色法測定人卵巢癌細胞株HO-8910的活性 取對數生長期的HO-8910細胞(2×105/孔)接種于6孔板上，加入不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)繼續培養0、6、12、24 h。貼壁細胞經胰酶處理后制成細胞懸液，然后加入0.4%臺盼藍溶液以9∶1混合均勻，3 min內在電子顯微鏡下計數活細胞和死細胞。

1.5 Western blot檢測HO-8910細胞自噬調節蛋白、PI3K/Akt通路相關蛋白及3-MA和RAPA作用后細胞自噬調節蛋白表達的變化 不同濃度土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)處理HO-8910細胞0、6、12、24 h后分別檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR等蛋白的表達。將HO-8910細胞分為空白對照組、土槿乙酸組(4 μmol/L)、土槿乙酸(4 μmol/L)聯合3-MA(10 mmol/L)組、土槿乙酸(4 μmol/L)聯合RAPA(10 μmol/L)組，分別培養24 h后檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1。常規收集各組細胞，洗滌、離心后加入細胞裂解液RIPA 和PMSF，提取細胞總蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，逐步進行上樣、電泳、轉膜、洗膜、封閉，按操作說明加入一抗，4 ℃搖床過夜;洗膜3次;加入二抗溶液，室溫搖床2 h；TBST室溫洗膜3次。ECL成像系統發光顯影。

1.6 統計學分析 采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料比較采用t檢驗。多組間數據比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 土槿乙酸抑制人卵巢癌細胞株HO-8910的活性 應用臺盼藍染色法測定土槿乙酸對人卵巢癌細胞株HO-8910的活性影響。用不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)作用HO-8910細胞株，作用時間為0、6、12、24 h。結果顯示，在作用時間相同時，隨著藥物濃度的增加，HO-8910細胞的活力下降；相同的藥物濃度下，隨藥物作用時間的延長，HO-8910細胞的活力亦隨之下降，且作用24 h后HO-8910細胞的活力下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。以上結果提示,土槿乙酸抑制人卵巢癌細胞株HO-8910的活性作用有時間依賴性及濃度依賴性。

2.2 土槿乙酸促進人卵巢癌細胞株HO-8910的自噬 應用Western blot方法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1等的表達情況。用不同濃度的土槿乙酸分別處理HO-8910細胞不同時間后，用Western blot法檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1。結果顯示，隨著土槿乙酸藥物濃度的增加或時間的延長，細胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達水平逐漸增強，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例也逐漸增加，Beclin-1蛋白的表達逐漸升高(圖1)；應用自噬特異性抑制劑3-MA后，自噬相關蛋白的表達減低，應用自噬激動劑RAPA后，LC3Ⅱ、Beclin-1等蛋白表達增加(圖2)。p-Akt、p-mTOR的表達隨時間的延長及濃度的增加均逐漸降低(圖3)。

圖1 用不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 mol/L)作用HO-8910細胞24 h后Western blot法檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達

圖2 Western blot法檢測不同組HO-8910細胞培養24 h后LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達。

圖3 用不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 mol/L)作用HO-8910細胞24 h后Western blot法檢測Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達

3 討論

卵巢癌為女性生殖系統常見的惡性腫瘤，其發病率逐年升高，嚴重威脅女性的健康。由于卵巢癌患者在早期往往沒有明顯的臨床癥狀，又缺乏有效的篩查手段，就診時多數已處于進展期或已有轉移，預后較差。臨床上常常采用手術、放療、化療、靶向治療等多種干預手段，但一部分患者因化療藥物耐藥而導致治療效果不佳，影響預后[10-12]。因此，尋找調節和對抗耐藥的方法，增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，是目前卵巢癌治療研究的熱點。

自噬是溶酶體中細胞器和未折疊蛋白分解代謝的生物學過程[13]。在細胞增殖中，自噬是一把雙刃劍，它不僅可以通過為細胞提供能量和營養，如細胞內蛋白質或組織的降解來促進細胞增殖，也可誘導自噬細胞死亡或與細胞增殖抑制程序交聯[14-15]。自噬是細胞死亡的重要機制,許多抗腫瘤藥物均通過提高自噬活性甚至誘導自噬來發揮抗腫瘤作用[16]。細胞自噬可通過多種途徑被激活，其調控點包括內質網應激、低氧誘導因子、PI3K、P53、caspase家族、Bcl-2家族等。細胞自噬亦參與腫瘤對化療藥物的反應[17-18]。LC3 是自噬重要的標志物之一。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 2種存在形式。LC3-Ⅱ通常存在于自噬體的外膜中。聯合應用自噬抑制劑3-MA和PAB后，自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1的表達降低，而自噬的激動劑RAPA與PAB聯用后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin-1蛋白表達增加。

PI3K/Akt信號通路是一種重要的細胞信號轉導通路，在細胞增殖、凋亡和細胞周期中均起著關鍵的調控作用[19]。PI3K/Akt通路也是自噬調節經典途徑，抑制該通路可起到活化自噬的作用。激活的PI3K啟動下游激酶Akt的激活[20]。此外，磷酸化Akt還能促進細胞的存活和增殖，調節各種信號傳導。研究表明，在胃癌、子宮內膜癌和前列腺癌等各種惡性腫瘤中，Akt的表達和激活過多。Yuan等[21]證實，Akt激酶的過度表達和激活與卵巢癌的惡性生物學行為有密切關系。本研究中，應用不同濃度的土槿乙酸處理HO-8910細胞后，p-Akt、p-mTOR的表達均有所下降，且存在濃度依賴性。這表明土槿乙酸可能通過抑制PI3K/Akt通路來促進HO-8910細胞的自噬。

總之，土槿乙酸可降低HO-8910細胞的存活率，誘導HO-8910細胞自噬，使自噬增加的程度存在藥物濃度及作用時間的依賴性。土槿乙酸可抑制PI3K/Akt通路，其抑制作用亦存在藥物濃度依賴性。因此，土槿乙酸可通過調節PI3K/Akt通路促進HO-8910細胞的自噬，土槿乙酸有望成為卵巢癌治療的新型藥物，也為中藥單體抗腫瘤的研究提供了新的實驗依據。