三氧化二砷抑制人肺癌細胞NCI-H460增殖并促進其凋亡實驗研究*

陳正浤，雷光焰，韓 樂，李遂新，徐宗君

1.陜西中醫藥大學(咸陽 712046)；2.陜西省腫瘤醫院胸外科(西安710061)

原發性支氣管肺癌是我國及世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康[1-2]。三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)為中藥砒石的主要成分，化學式為As2O3，在治療患有復發性或難治性急性早幼粒細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)患者展現出的功效已經令人矚目[3]。并且研究人員還發現它對其他血液系統惡性腫瘤有效，例如骨髓增生異常綜合征，多發性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤以及某些實體瘤，如肺癌[4]、結腸癌[5]、肝癌[6]、前列腺癌[7]等有治療作用。

材料與方法

1 實驗材料 人大細胞肺癌NCI-H460細胞株購自美國模式培養物保藏庫(America type culture collection，ATCC)；注射用三氧化二砷(10 mg/支，批號：20190501)。RPMI-1640培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。BCL2相關蛋白-X(BCL2-Associated X，Bax)、B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9)、周期蛋白依賴性激酶-1(Cyclin-dependent kinases，CDK1)、c-Myc兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG(二抗)以及CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。HERAcell CO2培養箱、生物安全柜(美國，賽默飛公司)；全自動酶標儀(美國，Bio-Tek公司) ;Primo vert倒置顯微鏡(德國，蔡司公司)；小型垂直電泳儀(美國，BIO-RAD公司);流式細胞儀(美國，BD公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養：人大細胞肺癌細胞株NCI-H460用含有10%的胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素RPMI-1640培養基，置于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中常規培養，每3 d更換1次培養基，待細胞生長至70%～80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

2.2 CCK-8法檢測As2O3對NCI-H460細胞的增殖：將處于對數生長期的NCI-H460細胞0.25%胰蛋白酶消化，配置成細胞懸液計數，以2×103個/孔的細胞接種于96孔板內；待細胞貼壁后，各組分別加入As2O3(0、2.5、5、10、15、20和 25 μmol/ml)干預，每組設置5個復孔，以生理鹽水作為對照組，PBS 作為調零組。在加藥后的24、48、72 h每孔分別加入CCK-8溶液10 μl，然后放置細胞培養箱中孵育0.5～1 h，在酶標儀上選擇450 nm波長處測量其OD值，計算藥物對細胞的增殖抑制率及IC50。抑制率= [(對照孔-實驗孔)/(對照孔-空白孔)]×100%。

2.3 集落形成實驗：根據CCK-8實驗篩選出的半數抑制濃度，分別設置As2O3濃度為5、10和15 μmol/ml組，以生理鹽水作為對照組。將As2O3(5、10和15 μmol/ml)作用NCI-H460 24 h后的細胞用0.25%胰蛋白酶消化并配置成單細胞懸液，倍比稀釋后接種于6孔板內，每孔接種200個細胞，每組設置3個復孔。加培養液10 ml放置培養箱中繼續培養12 d后，培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄去上清液，用PBS浸洗2次，加甲醇固定20 min，棄掉固定液，PBS浸洗2次。加0.1%結晶紫染色液染10～30 min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。在光學顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數，計算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆數/接種細胞數)×100%。

2.4 流式細胞技術檢測AS2O3對NCI-H460的細胞周期及凋亡率：分別將不同濃度AS2O3作用NCI-H460 24 h后的細胞，用PBS清洗兩次，收集細胞加入預冷75%乙醇固定，再用PBS洗去固定液，然后加入RNA酶反應4 ℃過夜，與碘化丙啶(PI)染液混勻后，室溫避光30 min，過200目篩網后流式細胞儀上機檢測，激發波長480 nm，并用ModfitLT 2.0軟件分析細胞周期和凋亡，計算各期細胞所占的比例及凋亡率。細胞凋亡率檢測采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染處理。

2.5 Western bolt檢測As2O3對NCI-H460細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CDK1、c-Myc蛋白表達水平的影響：收集不同濃度As2O3處理NCI-H460 24 h的細胞，加入蛋白酶抑制劑PMSF和RIPA裂解緩沖液(PMSF∶RIPA=1∶100)提取細胞總蛋白，在冰上裂解30 min，12000 r/min，4 ℃，離心15 min取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，并按比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，并將所需檢測的蛋白轉印至PVDF膜上，用5%牛奶室溫下封閉1 h，隨后分別將Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CDK1、c-Myc(稀釋比例均為1∶1000)兔單克隆抗體4 ℃孵育過夜，β-actin(1∶1000稀釋)作為內參對照。1×TBST 10 min清洗膜3次，再用HRP-山羊抗兔二抗(1∶10000稀釋)在室溫下孵育1 h，1×TBST 10 min清洗膜3次。最后采用ECL化學發光液在暗室用膠片顯影，蛋白條帶用image-J軟件定量分析。

結 果

1 As2O3抑制人肺癌NCI-H460細胞的增殖 采用CCK-8法檢測As2O3不同濃度(0、2.5、5、10、15、20和25 μmol/ml)干預NCI-H460細胞24、48、72 h后的增殖抑制能力，隨著藥物濃度的增加，As2O3的抑制率逐漸升高，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.001,圖1A)。并且As2O3的抑制率隨著時間的變化而明顯提升，說明As2O3能夠有效抑制肺癌NCI-H460細胞的增殖，呈劑量—時間依賴性。As2O324、48、72 h作用NCI-H460細胞的IC50分別為(15.88±1.49)μmol/ml、(6.33±0.36)μmol/ml、(5.09±1.33)μmol/ml。

為了進一步驗證As2O3對NCI-H460細胞增殖能力的影響，采用集落形成實驗觀察As2O3(5、10和15 μmol/ml)作用NCI-H460細胞24 h后的克隆形成率。在加藥作用24 h后，隨著藥物濃度的增加，NCI-H460細胞的克隆形成率及大小均明顯減弱。對照組和As2O3(5、10和15 μmol/ml)克隆形成率分別為：(56.67±5.1)%、(29.56±1.13)%、(17.36±1.42)%、(6.26±1.36)%；與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.001,圖1B)。

注：與對照組比較，***P<0.001圖1 CCK-8法(A)和集落形成實驗(B)檢測不同濃度As2O3對NCI-H460細胞增殖的影響

2 As2O3對NCI-H460細胞周期的影響 隨著藥物濃度的增加，對照組與As2O3(5、10和15 μmol/ml)組G0/G1期所占細胞比例逐漸減少，S期、G2/M期細胞數量增加，以G2/M期細胞數量增加更為明顯。其中G2/M期所占細胞比例分別為(12.13±1.24)%、(14.33±1.12)%、(26.22±1.58)%、(31.83±2.76)%，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.001)；S期所占細胞比例無統計學意義差異(P>0.05,圖2A)。說明As2O3作用NCI-H460的細胞周期阻滯主要發生在G2/M期，與藥物濃度呈正相關。此外，隨著As2O3濃度的增加，As2O3(10、15 μmol/ml)組下調CDK1、c-Myc表達；與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05、P<0.01,圖2B)。

3 As2O3誘導NCI-H460細胞凋亡 對照組與As2O3(5、10、15 μmol/ml)組的細胞凋亡率分別為(14.13±0.77)%、(15.66±0.78)%、(30.4±0.45)%、(45.26±0.81)%。隨著藥物濃度的增加，NCI-H460細胞的凋亡率逐漸遞增； 10、15 μmol/ml藥物組與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.001，圖3A)。當As2O3濃度為5、10、15 μmol/ml時可以下調Bcl-2蛋白表達(P<0.01)，上調Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(P<0.05、P<0.01和P<0.001,圖3B)。

討 論

在肺癌中，As2O3的抗癌作用涉及抑制腫瘤干細胞樣細胞、通過阻滯周期抑制增殖、誘導細胞凋亡、抗血管生成、化療和放療的增敏、低氧環境的抗癌作用，以及免疫調節作用[8]。我們在體外觀察了As2O3對人肺癌細胞株NCI-H460細胞增殖的影響。結果發現As2O3顯著抑制了NCI-H460細胞的增殖和生長，并且抑制作用隨著藥物濃度的增加、作用時間延長而明顯增強，呈時間—濃度依賴性。

細胞周期調控失控是肺癌發生的主要原因之一。因此，誘導腫瘤細胞周期阻滯的藥物成為腫瘤治療中關注的焦點。研究表明As2O3可以通過誘導腫瘤細胞G2/M期阻滯作為一種有效的抗癌藥物[9-10]。為了驗證As2O3對NCI-H460細胞周期的影響，我們檢測了經過As2O3干預NCI-H460細胞24 h后的細胞周期變化，發現As2O3對H460的細胞周期阻滯發生在G2/M期，與藥物濃度呈正相關。并且我們還發現As2O3下調了CDK1、c-Myc蛋白表達，這可能與As2O3參與阻滯NCI-H460細胞周期有關。

有研究報道，As2O3通過下調Bcl-2蛋白表達并誘導G2/M細胞周期阻滯來誘導凋亡[11-12]。Bcl-2是已知重要的抗凋亡蛋白，可以通過線粒體凋亡途徑發揮抗凋亡作用。通過誘導Bcl-2蛋白表達下調，促凋亡蛋白Bax表達上調，可導致線粒體外膜通透性(MOMP)增加、線粒體膜去極化(MMD)和細胞色素C釋放，激活Caspase級聯反應[11]。許多研究表明As2O3下調Bcl-2蛋白誘導肺癌細胞凋亡[9,13-14]，上調Bax促進癌細胞凋亡[13]，這和我們的研究結果一致。

此外，As2O3激活Caspase信號傳導途徑，降低線粒體膜電位并促進活性氧(ROS)的產生，導致細胞凋亡[12]。Caspase依賴的細胞凋亡可分為外源性死亡受體介導的凋亡途徑和線粒體介導的內源性凋亡途徑，其中Caspase-3是細胞凋亡的主要效應因子和關鍵的執行者，Caspase-9是細胞凋亡啟動蛋白酶[15]。在本研究中我們觀察到As2O3對NCI-H460細胞以劑量依賴的方式，通過下調Bcl-2、上調Bax蛋白表達，激活Caspase-9、Caspase-3促進了細胞凋亡。

因此，深入研究As2O3作為肺癌的候選藥物具有重要意義。本研究揭示了As2O3能有效抑制人大細胞肺癌細胞株NCI-H460的增殖，并且可以阻滯細胞周期，誘導相關凋亡蛋白發揮其促凋亡的作用。這為我們今后進一步開展As2O3在肺癌中的研究提供了一定的理論與實驗依據。