三種方法聯合檢測診斷結核性胸腔積液60例臨床研究*

王科文，吳勝波，馬紀龍，張 寧，劉 莉△

1.解放軍聯勤保障部隊987醫院結核科(寶雞 721006)；2.解放軍陸軍第946醫院(伊犁 835000)；3.陜西省結核病防治院(西安 710100)

胸膜疾病最常見的臨床表現是胸腔積液，據統計我國每年胸腔積液發病患者約672萬，分為漏出液和滲出液。滲出性胸腔積液最常見于結核性胸腔積液(Tuberculous pleural effusion，TPE)和非TPE(主要是類肺炎性胸腔積液和惡性胸腔積液)。我國既往大樣本胸腔積液數據資料顯示TPE約占46.7%[1]，因胸水涂片及結核菌培養陽性率均低，胸腔鏡下胸膜活檢盡管陽性率高，但技術要求高，價格昂貴且為有創檢查[2]，難以在廣大中小型醫院普及。γ-干擾素釋放試驗(IGRA)和結核菌核糖核酸(TB-RNA)是近年興起的兩種新的結核病輔助診斷技術，兩者單一應用時存在一定局限性，二者聯合胸水腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase,ADA)可極大提高TPE的診斷準確率，且易于在臨床開展?，F通過回顧性分析2017年10月至2019年11月我院采用上述三種方法用于臨床診斷TPE，并探討三者聯合檢測在其診斷中的價值，現報告如下。

資料與方法

1 一般資料 選取2017年10月至2019年11月解放軍聯勤保障部隊987醫院結核科收治的胸腔積液患者103例。研究臨床診斷為TPE患者60例，納入TPE組，其中男49例，女11例，年齡18～79歲，平均(38.9±11.2)歲。對照組為非TPE患者43例(其中惡性胸腔積液28例，類肺炎性胸腔積液6例，其他原因9例)，全部經過胸水細胞病理學檢查和(或)胸膜組織病理活檢等相關輔助檢查確診。其中男35例，女8例，年齡35～81歲，平均(45.8±12.6)歲。本研究通過醫院倫理審查，各組患者均知情同意并簽署同意書。所有入選對象均排除HIV感染、嚴重肝腎功能不全、妊娠以及自身免疫性疾病。結核性胸腔積液臨床診斷標準[3]：臨床表現為有發熱、盜汗、胸痛、乏力、氣短等癥狀，胸部CT顯示肺內無惡性腫瘤相關表現，腫瘤標志物無明顯異常，胸水ADA>45 U/L，胸水細胞以淋巴細胞為主，排除其他原因引起的胸腔積液，3次胸水病理細胞學送檢均未找到腫瘤細胞，抗結核治療有效。結核性胸腔積液確診診斷標準[4]：①胸液涂片或培養查見結核分枝桿菌；②經皮胸膜活檢或胸腔鏡活檢病理確診；符合上述一條以上為符合診斷標準。

2 研究方法

2.1 標本采集：兩組患者均在無菌操作下經胸腔穿刺術或胸腔閉式引流術收集胸水并立即送檢IGRA、胸水腺苷脫氨酶(ADA)以及胸水結核菌核糖核酸(TB-RNA)。

2.2 檢測方法：IGRA檢測：收集胸水約15～20 ml置入肝素鋰試管，采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測IFN-γ，具體操作流程參考外周血IGRA，計算γ-干擾素水平，以INF-γ>60 pg/ml為陽性。胸水ADA采用連續檢測法，收集胸水約10 ml離心后取上清液3 ml，檢測設備為全自動生化分析儀，采用酶速率法進行檢測，以胸水ADA>45 U/L定義為陽性。TB-RNA檢測：取胸水標本8～10 ml，加入1～2倍體積的4%的NaOH于無菌樣品管中渦旋震蕩1 min以充分勻化。取液化好的胸水標本3～5 ml于樣品收集管中，13000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 ml生理鹽水重懸洗滌，13000 r/min離心5 min，棄上清，加入50 μl TB稀釋液重懸，該樣本即為待測樣本。將50 μl待測樣本及50 μl已制備好的陽性對照與陰性對照超聲處理15 min，取2 μl 處理物加入到含30 μl 擴增檢測液的潔凈微量反應管中。將微量反應管置干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min，取出反應管置于恒溫混勻儀上42 ℃保溫5 min，同時將實時熒光核酸恒溫擴增技術(SAT)酶液42 ℃預熱10 min，保持微量反應管于恒溫混勻儀上，向微量反應管加入10 μl已預熱的酶液，立即蓋上管蓋或貼膜振蕩15 s混勻，將微量反應管轉至熒光檢測器，立即啟動反應程序進行檢測。IGRA所用檢測試劑均為北京萬泰生物公司提供，TB-RNA檢測試劑盒由上海仁度生物科技有限公司提供，操作均按照相關說明書進行實施。

3 統計學方法 使用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行處理，計數資料的比較采用χ2檢驗，計算胸水IGRA、胸水ADA以及胸水TB-RNA檢測的敏感度、特異度、一致性及IGRA+ADA、ADA+TB-RNA、TB-RNA+IGRA和IGRA+ADA+TB-RNA敏感度、特異度、一致性等。三種檢測方法的一致性采用一致性檢驗，用Kappa(K)值表示，K值>0.75認為一致性好，0.4

結 果

1 不同檢測方法的陽性率比較 60例診斷為TPE的患者胸水IGRA陽性率為76.67%(46/60)，胸水ADA陽性率為85.0%(51/60)，胸水TB-RNA陽性率為81.67%(49/60)，三者同時陽性者的陽性率為63.33%(38/60)；43例診斷為非TPE患者中，胸水IGRA陽性率為9.30%(4/43)，胸水ADA陽性率為11.63%(5/43)，胸水TB-RNA陽性率為6.98%(3/43)，三者同時陽性者0例。

2 三種檢測方法診斷價值比較 以臨床診斷為標準，胸水IGRA、ADA和TB-RNA在TPE診斷中的靈敏度分別為76.7%、85.0%、81.7%；特異度分別為90.7%、88.4%、90.7%，約登指數分別為0.674、0.734、0.724。就靈敏度而言，三種檢測方法中，ADA靈敏度最高(85.0%)，IGRA最低(76.7%)；從特異度而言，IGRA(90.7%)與TB-RNA(90.7%)均高于ADA(88.4%)，ADA約登指數為(0.734)，TB-RNA次之(0.724)，IGRA最低(0.674)。各檢測方法與臨床診斷結果比較差異均有統計學意義(P<0.001)，見表1。

表1 三種檢測方法診斷價值比較

3 三種檢測方法聯合對TPE診斷價值比較 采用兩種及兩種以上檢測方法聯合進行診斷，以臨床診斷為標準，IGRA+ADA、ADA+TB-RNA、TB-RNA+IGRA和IGRA+ADA+TB-RNA靈敏度分別為91.7%、95.0%、90.0%、96.7%；特異度分別為81.4%、79.1%、83.7%、74.4%，約登指數分別為0.731、0.741、0.737、0.711。其中IGRA+ADA+TB-RNA靈敏度最高(96.7%)，TB-RNA+IGRA靈敏度最低(90.0%)，TB-RNA+IGRA特異度最高(83.7%)，IGRA+ADA+TB-RNA特異度最低(74.4%)，ADA+TB-RNA約登指數最高(0.741)，IGRA+ADA+TB-RNA約登指數最低(0.711)。IGRA、ADA、TB-RNA三種方法的聯合檢測與臨床診斷結果比較差異均有統計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 三種檢測方法聯合對TPE診斷價值比較

討 論

TPE是由于結核桿菌及其自溶、代謝產物進入超敏感機體胸膜腔，導致胸膜產生高度變態反應而發生的胸膜炎癥[5]。由于胸膜腔的無菌性特征，故胸水涂片和胸水結核菌培養陽性率均偏低，而胸腔鏡下胸膜活檢盡管陽性率高，但存在技術操作較復雜、價格昂貴以及為有創等缺點，難以在廣大中小型醫院開展，故長期以來TPE的診斷主要靠多種檢查手段綜合分析判定。IGRA檢測原理是在結核分枝桿菌(MTB)感染患者外周血或感染部位體液中會產生記憶T淋巴細胞并長期在人體內存在，當再次受到MTB相關抗原刺激后會迅速增殖成為效應T淋巴細胞并分泌γ-干擾素[4-5]，通過測定T細胞γ-干擾素釋放反應可用來檢查患者是否受到MTB感染[6]。目前在應用外周血或胸水作為IGRA標本選擇上尚存在一定爭議，多數學者傾向于采用外周血IGRA診斷TPE，且獲得了較高的診斷敏感度和特異度。Ates等[7]研究發現采用胸水IGRA診斷TPE準確性較差，但Liu等[8]發現采用胸水或者外周血IGRA診斷TPE，二者靈敏度均可達到90%以上，與劉慧梅等[9]研究結果一致。而周敏等[10]研究結果表明，與外周血IGRA比較，胸腔積液IGRA可能對TPE診斷價值更高。劉亞亞等[4]研究顯示胸水IGRA單獨診斷TPE時其靈敏度、特異度分別為96.38%、29.31%，而聯合ADA診斷TPE時其靈敏度、特異度分別為81.88%、98.28%。本研究結果顯示胸水IGRA診斷TPE靈敏度、特異度分別為76.67%、90.70%，與上述研究結果存在一定差異，考慮與所選樣本量較小有關。本研究結果顯示采用聯合檢測后靈敏度較單項檢測均有明顯提高，IGRA+ADA+TB-RNA三者聯合時靈敏度最高為96.7%，更有利于TPE診斷。胸腔積液γ-干擾素水平增高有助于TPE的診斷，研究顯示胸腔積液γ-干擾素水平>3.7 U/ml TPE的診斷敏感性和特異性均可達到98%以上，明顯高于胸腔積液結核菌涂片和培養陽性率，但膿胸患者胸腔積液γ-干擾素水平亦可增高[1]，故需要在臨床上進一步鑒別。

ADA是T淋巴細胞的一種重要的酶，其廣泛存在于全身組織中，其功能為催化腺苷脫氨生成肌酐，與細胞免疫活性有關。ADA活性增高與T淋巴細胞的激活、增值、分化有關。TPE患者因細胞免疫受刺激，淋巴細胞明顯增多，故ADA在TPE中的含量較惡性胸腔積液及右心功能不全引起的胸腔積液均顯著增高，表明胸腔積液ADA測定對上述胸腔積液的鑒別有重要意義[11]。既往關于ADA診斷TPE薈萃分析顯示：ADA在TPE診斷中具有較高的價值，也可作為TPE的診斷標準[12-13]。目前國內多以ADA(>45 U/L)作為診斷TPE的臨界值，胸腔積液ADA/血清ADA>1也是目前診斷TPE的常用指標之一。大量研究顯示ADA在TPE的診斷上具有較高的準確度、敏感度和特異度，但檢測結果也存在假陰性或假陽性的問題，文獻報道ADA有時存在診斷的敏感度和特異度偏低的情況，敏感度低多考慮與機體免疫功能減退(如感染人免疫缺陷病毒)或炎癥早期有關[13]。但值得注意的是：胸腔積液ADA水平升高也可出現在肺炎旁胸腔積液、類風濕性疾病所致胸腔積液、肺吸蟲病以及大多數膿胸患者中，此外在一些較為罕見的疾病如Q熱和布魯斯桿菌病患者中亦可表現為增高[14]，故在上述疾病中特異度較低。本研究結果表明ADA在TPE診斷中具有較高的特異度(88.37%)。大量研究表明以>45 U/L為界，其診斷TPE總的準確度可達到99.2%、敏感度為100%、特異度為98.6%[11]，與本研究結果存在一定偏差，考慮與所選樣本量較小有關。此外，研究表明胸腔積液ADA數值與TPE診斷呈正相關，即胸腔積液ADA水平越高，患TPE可能性越大[15-16]。

實時熒光核酸恒溫擴增技術(SAT)是基于PCR發展起來的一種核酸序列擴增的新技術，以病原體RNA為檢測模板，具有高度的敏感性和特異性[11]，無需溫度循環，反應速度快，擴增效率高。另外因SAT不需要經過高溫變性步驟，即使在有背景DNA的存在亦不會受到影響，故其檢測敏感性和準確性均明顯高于其他分子檢測技術。Cui等[17]采用SAT技術檢測MTB，靈敏度可達到100 CFU/ml，在菌陰患者標本中陽性率39.2%，結果與臨床診斷一致。林忠惠等[18]研究發現胸水TB-RNA在TPE診斷上具有較高的靈敏度和特異度，與本研究結果基本一致。因RNA只存在于活的結核分枝桿菌內，故TB-RNA檢測技術亦可用于活動性肺結核的診斷和治療效果的監測，尤其對菌陰肺結核具有更高的臨床診斷價值[19-20]。此外SAT技術可輔助判斷抗結核治療的效果，羅賢等[21]采用SAT技術快速檢測治療前后痰標本中的MTB，發現其對痰中結核桿菌具有較高的靈敏度，可用于肺結核早期診斷和治療療效的判斷，并可為治療方案的早期調整提供參考。但目前在應用基因檢測技術診斷肺外結核病時尚存在標本處理不當、操作方法不規范、技術不過關、擴增系統操作較復雜等技術方面問題，存在假陽性，進而間接造成檢測結果出現誤差[22]。

崔魁麗等[23]研究發現，TPE特別是合并有明顯胸腔積液的患者，其體內γ-干擾素、ADA表達水平明顯高于非結核組。本研究結果顯示聯合應用上述三種檢測技術，可以進一步提高臨床診斷TPE的靈敏度，降低漏診率，值得推廣使用。