肺癌癌組織中過氧化物酶增殖體激活受體γ基因表達水平對培美曲塞化療療效的預測價值*

楊 昕，劉 芳，杜 靜，張繼朋

1.陜西中醫藥大學第二附屬醫院病理科(咸陽 712000)；2.空軍軍醫大學唐都醫院胸外科(西安 710038)

隨著空氣污染問題的不斷惡化，肺癌作為目前發病率及病死率最高的惡性腫瘤，其發病率及病死率依然不斷上升[1]，非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常見的類型，還可以進一步分為腺癌、鱗癌及大細胞癌[2]，早期NSCLC選擇手術治療可以極大的提高生存時間，但超過75%的患者確診時已是中晚期，錯過了最佳治療時機，這也是目前NSCLC 5年生存率不超過20%的重要原因[3]。培美曲塞是經美國食品和藥物管理局批準用于治療NSCLC的抗葉酸代謝抗腫瘤藥物，對于NSCLC有著很好的療效且毒性較低，對其他腫瘤也有不錯的療效[4]。過氧化物酶增殖體激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是由配體激活的一類重要轉錄因子，有3種亞型，其中PPARγ位于多種信號途徑轉導的交叉點位置，在機體的多種生理及病理過程中都發揮著重要的調控作用[5]，并且有報道其與腫瘤進程的關系密切[6]。目前PPARγ表達水平與培美曲塞治療NSCLC療效之間關系報道較少，本次研究利用qRT-PCR檢測了化療前PPARγ的表達水平，并分析了PPARγ表達水平與培美曲塞化療療效及遠期預后之間的關系。

資料與方法

1 一般資料 選取我院2014年1月至2017年1月診治的經組織病理學驗證為晚期NSCLC患者80例為研究對象。病例納入標準：①經組織病理學或細胞學診斷為NSCLC，且影像學資料提供可測病灶，根據國際肺癌研究協會TNM分期[7]證實為Ⅲ期及Ⅳ期；②首次化療，未進行過手術、放療及分子靶向治療；③適合且能夠耐受培美曲塞聯合順鉑治療；④化療期間為同步或序貫接受放療及其他抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②預計生存期<3個月；③嚴重心、肝、腎功能不全者；④合并血常規及心電圖結果異常；⑤無法配合完成治療及復查者。80例入組患者中男44例，女36例，年齡40～72歲，中位年齡57歲，TNM分級Ⅲ b期21例，Ⅳ期59例。

2 研究方法

2.1 化療方法：所有患者的治療用量均根據體表面積計算。首日給予培美曲塞500 mg/m2，順鉑75 mg/m2，靜脈滴注。并于化療前1周開始口服葉酸400 μg/d，持續時間超過5 d，一直持續到末次給予培美曲塞后21 d，化療前1 d至給藥后1 d，3 d連續給予地塞米松4 mg口服，2次/d，并在化療前1周于肌肉主色維生素B121000 μg，每3周期重復一次。每化療2個周期評價一次。

2.2 PPARγ表達檢測方法：按照試劑盒中說明書操作步驟提取瘤組織及對應正常組織的總RNA，提取后用紫外分光光度計檢驗，OD值(A260/A280)=1.8～2.1，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性；按照試劑盒種說明書進行cDNA的合成。反轉錄體系(10 μl)：2×miRNA反應混合液5 μl，0.1% BSA 1 μl，miRNA PrimeScript RT酶混合物1 μl，總RNA0.5 μl，去RNA酶ddH2O 2.5 μl。反應條件設置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。PCR體系10 μl：SYBR Prmix Ex Tap II(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX Reference Dye II(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl。詳細操作見試劑盒說明書。PCR反應參數設置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應進行40個循環。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。內參基因采用β-actin，PPARγ擴增引物：上游引物5’-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG-3’，下游引物5’-AGGACTCAGGGTGGTTCAGC-3’。每個樣孔設置3個復孔，取平均Ct值進行分析，以2-△△Ct作為相對表達量。

3 化療效果評價標準 每化療2個周期進行1次影像學復查，療效評價參照RECIST標準判定。完全緩解：影像學可見腫瘤完全消失；部分緩解：可測量病灶體積縮小超過30%；穩定：介于部分緩解和進展之間；進展：可測量病灶體積增大超過20%或有新的病灶出現。客觀有效率(ORR)=完全緩解率+部分緩解率，疾病控制率(DCR)=完全緩解率+部分緩解率+穩定率。

4 隨 訪 患者自病理確診之日起開始門診復查或電話隨訪，治療后1年內每3個月門診復查1次，2年內半年復查1次，以后至少每年復查一次，隨訪截止2019年1月，最少隨訪24個月，以患者死亡為研究重點。隨訪記生存時間及隨訪時狀態(存活、死亡或其他)等。

結 果

1 化療前癌組織中及癌旁組織中PPARγ表達水平 癌組織中PPARγ mRNA相對表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 化療前肺癌組織中及癌旁組織中PPARγ表達水平

2 化療療效及病情控制與病情進展患者癌組織中PPARγ表達水平 根據治療過程中影像學檢查結果，完全緩解0例(0.00%)，部分緩解26例(32.50%)，穩定35例(43.75%)，進展19例(23.75%)，ORR為32.50%(26/80)，DCR為76.25%(61/80)；疾病控制組PPARγ mRNA表達水平高于病情進展組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 病情控制組和病情進展組中PPARγ表達水平

3 PPARγ表達水平對培美曲塞化療療效預測價值的ROC分析 ROC分析結果顯示，PPARγ表達水平預測培美曲塞化療有效的AUC=0.779，95%CI：0.673～0.885，Cutoff值為2.855(圖1)。

圖1 PPARγ表達水平對培美曲塞化療療效預測價值的ROC曲線

4 PPARγ表達水平與PFS間的關系 以ROC的cutoff值將所有患者分為PPARγ高表達組及PPARγ低表達組，PPARγ高表達組有51例，PPARγ低表達組有29例。80例NSCLC患者2年內死亡42例，存活率為47.50%，Kaplan-Meier曲線結果顯示PPARγ高表達組的2年總生存率58.82%(30/51)顯著高于PPARγ低表達組的27.59%(8/29)。見圖2。

圖2 PPARγ表達水平與2年生存率的關系

討 論

培美曲塞作為一種抗葉酸代謝類抗腫瘤藥物，能夠抑制葉酸代謝過程中的3種關鍵酶活性，葉酸是人體必需的一類水溶性B族維生素，參與人體胸腺嘧啶及嘌呤的合成，培美曲塞主要就是通過抑制葉酸的合成，導致DNA和RNA的合成受阻，最終發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[8]。正是由于培美曲塞的多靶點性，其在臨床抗腫瘤的運用上有不錯的效果，尤其是對肺腺癌具有顯著的抑制作用[9]，同時在用于非鱗NSCLC一線及二線治療的效果也要優于多西他賽、吉西他濱等常用化療藥物[10]。本研究結果顯示，對肺癌晚期患者進行培美曲塞聯合順鉑化療治療發現，其ORR為32.50%，DCR為76.25%，表明培美曲塞聯合順鉑化療的效果良好，能夠很好的控制住患者病情的進展。陳紅等[11]研究發現培美曲塞聯合順鉑治療復發性肺腺癌患者的ORR為57.50%和87.50%，與本研究結果較為接近。

PPARγ是Ⅱ型核激素受體超家族中的一員，作為一種配體依賴性轉錄因子，在人體脂肪組織、乳腺、結腸、肺、卵巢、胎盤等中高表達，其在促進脂肪細胞的分化過程中發揮著重要的作用[12]。正是由于PPARγ的促分化效應，故而其被激活后還有抗細胞增殖功能，目前人體內發現的PPARγ配體主要是前列腺素，大量研究[13]表明，PPARγ配體可以通過影響腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲等過程來調控腫瘤的進程。本研究結果顯示，PPARγ在肺癌組織中的相對表達量顯著高于癌旁正常組織，這與李虹等[14]研究相一致，同時我們還發現，化療前PPARγ水平越低，其化療效果可能越差。可能是因為PPARγ具有調控癌細胞培美曲塞敏感性作用，高表達的PPARγ增加了肺癌細胞的培美曲塞敏感性，因此表達量越高培美曲塞化療效果越好。李強等[15]研究發現，胃癌中PPARγ的mRNA表達量顯著高于正常組織，同時高表達PPARγ患者的預后要優于表達患者，與本研究結果相符。

我們利用ROC曲線評估了PPARγ表達水平對培美曲塞化療療效預測價值，發現PPARγ表達水平預測培美曲塞化療療效的AUC達到了0.779，表明PPARγ表達水平具有不錯的預測培美曲塞化療療效的效果價值。根據Cutoff值將患者分為PPARγ高表達組和PPARγ低表達組，進行Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，PPARγ高表達組的2年內無病生存率高于PPARγ低表達組，提示PPARγ表達水平還具有遠期預后的預測價值。

綜上所述，由于肺癌患者多半發現已是晚期，故而治療多以延長患者的生存期及生活質量為主，在化療的過程中對其療效預測及及時的區分化療不敏感患者具有重要的臨床意義，PPARγ作為一種抑癌基因，其表達水平具有很好的臨床指導意義，PPARγ高表達患者的化療效果及2年內生存率均要優于PPARγ低表達患者，同時也表明PPARγ可以作為一種定向治療的靶點。但由于本研究樣本較小，因此還需要進行大樣本前瞻性隨機研究，進一步明確PPARγ表達水平的預測價值。