白酒釀造窖泥未培養微生物菌群的可培養化策略

盧萌萌，任聰,2*，聶堯,2*，徐巖,2

1(江南大學 生物工程學院，釀造微生物學與應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室 (江南大學)，江蘇 無錫，214122)

從釀造方式來分，白酒可以分為窖泥依賴型與窖泥非依賴型。窖泥依賴型白酒主要包括濃香型、醬香型、鳳香型、芝麻香型、兼香型和特香型白酒等；窖泥非依賴型白酒主要包括清香型、老白干香型、米香型和豉香型白酒等。窖泥中富含多種多樣的微生物，如己酸菌、丁酸菌等，這些微生物多為厭氧菌，其代謝產生的脂肪酸、脂肪醇與酒醅中的乙醇、乳酸和乙酸等物質反應生成了種類繁多的酯類物質，賦予窖泥依賴型白酒窖香濃郁、綿甜等風味特征。在眾多窖泥依賴型白酒中，濃香型白酒的質量與窖泥質量的相關性最為密切，優質窖泥是生產優質濃香型白酒的重要決定因素之一，而影響窖泥質量的根本因素為定植于其中生長的窖泥微生物。此前有研究表明，窖泥中存在的微生物可至少歸類于225個屬，其中至少31個屬為主要的高豐度微生物[1]。然而，除部分己酸菌和丁酸菌外，其余眾多窖泥微生物的具體物種信息及其在窖泥和釀造過程中的功能尚未可知。由ZHU等[2-3]分離于某濃香型白酒窖池中的梭菌綱微生物CPB6菌株，被鑒定為1株重要的產己酸菌；CHAI等[4-5]從窖泥中分離得到了多株梭菌綱下的產丁酸細菌。除梭菌綱微生物外，窖泥中還棲息著如擬桿菌綱、甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱等豐度較高的微生物，其中產甲烷菌被推斷為具有通過與產酸細菌進行互營代謝促進己酸生成的功能[6]。

對于窖泥微生物的結構和功能解析，可利用擴增子測序技術解析窖泥微生物結構，而廣泛采用的二代高通量測序技術因讀長限制，一般僅能將微生物種類精確鑒定到屬水平；對窖泥微生物的釀造功能解析需借助基于全基因組解析的宏基因組學技術，應用該項技術的最大障礙在于提取完成的DNA較為困難，目前僅有少數報道通過宏基因組學技術手段對窖泥微生物結構和功能進行解析[7]。富集培養方法是實現窖泥微生物全基因組結構解析的重要途徑。然而現有的研究表明，實驗室人工條件下富集得到的微生物菌群組成大多結構單一，大量窖泥微生物仍然處于難以被富集和培養的狀態。這對全面研究窖泥微生物菌群在濃香型白酒發酵過程中的作用造成較大阻礙。

富集培養通常被作為環境微生物可培養化研究的首要步驟。為盡可能多地實現未培養窖泥微生物在實驗室環境中的可培養化，本研究采用經過配方改進的CGM[8]、NBM[9]以及MCI[10]三種培養基，對濃香型白酒窖泥菌群進行富集。其中CGM培養基屬于富營養培養基，NBM和MCI屬于寡營養培養基。隨后結合16S rRNA基因擴增子測序技術，對富集菌群結構和動態變化進行分析，挑選出一種適合于最大程度還原窖泥樣品原位菌群種類的富集培養基。本研究發現,寡培養條件對于最大程度富集獲取窖泥中的未培養微生物菌群具有重要的作用，為實現更多種類的未培養窖泥微生物可培養化奠定了堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 富集樣品

富集用種泥來自于江蘇省某濃香型白酒酒廠窖池。

1.1.2 培養基組成及相關試劑

CGM培養基(g)：葡萄糖20，(NH4)2SO42，K2HPO41，KH2PO40.5，蛋白胨10，酵母粉10，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.15，CaCl20.01，MnSO40.01，CoCl2·6H2O 0.002，ZnSO40.002，1 g/L的刃天青溶液1 mL，加蒸餾水定容至1 L，滅菌前調pH至7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min。

NBM培養基(g)：KNO31，酵母粉3，蛋白胨5，牛肉膏3，1 g/L的刃天青溶液1 mL，加蒸餾水定容至1 L，滅菌前調pH至7.0±0.2，121 ℃滅菌20 min。

MCI培養基(mL)：礦質元素溶液50，微量元素溶液1，B族維生素溶液5，NaHCO3溶液70，Na2SO4溶液20，三水合乙酸鈉5 g，酵母粉1 g，蛋白胨1 g，1 g/L的刃天青溶液1 mL。滅菌前調pH至7.4±0.2，121 ℃滅菌20 min。滅菌后將維生素溶液、NaHCO3溶液和Na2S溶液在厭氧條件下按比例添加至培養基內，定容至1 L。

礦質元素溶液母液(g)：KH2PO410，MgCl2·6H2O 6.6，NaCl 8，NH4Cl 8，CaCl21，添加蒸餾水定容至1 L。

微量元素溶液母液(g)：ZnSO4·7H2O 0.1，MnCl20.03，硼酸0.3，CoCl2·6H2O 0.2，CaCl20.01，NiCl2·6H2O 0.02，鉬酸鈉0.03，FeCl2·4H2O 1.5，添加蒸餾水定容至1 L。

B族維生素溶液母液(mg)：煙酸20，鈷胺素20，鹽酸硫胺10，對氨基苯甲酸10，鹽酸吡哆醇50，泛酸鈣5，添加蒸餾水定容至1 L，過濾除菌。

NaHCO3溶液：NaHCO35 g，添加蒸餾水定容至100 mL，過濾除菌。

Na2S溶液：Na2S 3 g，添加蒸餾水定容至100 mL，121 ℃單獨滅菌20 min。

以上試劑中，酵母粉與蛋白胨購于Oxoid公司，其余常規試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備

厭氧產氣袋，日本三菱瓦斯化學株式會社；Forma 1029厭氧培養箱，美國Thermo Scientific公司；NanoDrop 8000蛋白核酸測定分光光度計，美國Thermo Fisher NanoDrop技術公司；FE 20型pH計，瑞士Mettler Toledo公司；DNeasy土壤微生物基因組DNA提取試劑盒，德國Qiagen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥接種和菌群培養

CGM培養基：將培養基分裝至50 mL離心管中，隨后在厭氧條件下接種質量濃度100 g/L的窖泥樣品，在37 ℃厭氧條件下進行靜置培養。

NBM培養基：將培養基分裝至50 mL離心管中，隨后在厭氧條件下接種質量濃度100 g/L的窖泥樣品，在37 ℃厭氧條件下進行靜置培養。

MCI培養基：滅菌前將培養基等分至100 mL血清瓶內，滅菌后添加Na2S、NaHCO3和B族維生素溶液定容至100 mL，隨后在厭氧條件下接種質量濃度100 g/L的窖泥樣品，在37 ℃厭氧條件下靜置培養。

1.2.2 宏基因組DNA提取

富集時序進程樣品宏基因組DNA提取通過DNeasy土壤微生物基因組DNA提取試劑盒提取完成，操作步驟參考說明書。

1.2.3 PCR擴增及擴增子測序

本研究選取16S rRNA基因的V4區進行PCR擴增，對CGM、NBM和MCI的富集樣品菌群結構進行分析，擴增引物為515FmodF(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806RmodR(5′-GGACTACNVGG-GTWTCTAAT-3′)[11-12]。對擴增的PCR產物進行建庫，使用PE250策略在Illumina Miseq平臺進行測序。測序數據的分析通過上海美吉生物制藥有限公司的i-sanger云平臺完成。使用FLASH進行高質量堿基和pair-end雙端reads拼接[13]。短于50 bp的序列通過使包含在QIIME(ver.1.9.1)[14]中的Trimmomatic移除。之后，使用Usearch 7.0[15]中的UPARSE對97%相似水平下的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)進行聚類統計分析。將OTU代表序列與Silva數據庫(ver.128)進行比對，得到每個OTU所對應的物種分類信息。

1.2.4 宏基因組測序

使用宏基因組測序技術對MCI培養基典型富集樣品的菌群結構和功能信息進行分析。建庫宏基因組的DNA由早期和中期富集樣品的DNA混合而成。宏基因組DNA的文庫構建和測序由上海美吉生物制藥有限公司完成。通過NEXTFLXTM快速DNA-Seq試劑盒構建400 bp的文庫，使用PE150策略在Illumina HiSeq 2500平臺上進行測序。通過使用Seqprep和Sickle獲得高質量pair-end雙端reads。通過使用Megahit[16]對測序數據進行多重混合拼接組裝，得到拼接效果最佳的序列。通過使用CDD-HIT[17]軟件對樣品中所有的預測基因序列進行聚類(默認參數：90% identity，90% coverage),取每個類別最長的基因作為代表序列。構建非冗余基因集。使用DIAMOND[18]中的BLASTP(BLAST Version 2.2.28+)[19]將非冗余基因集與NR數據庫進行比對，通過對應的分類學信息數據庫獲得物種注釋結果。

2 結果與分析

2.1 不同培養基富集條件下的菌群結構差異

本研究旨在通過使用不同的培養方法探究最適于培養和富集窖泥微生物菌群的培養基條件。首先使用了培養梭菌較為常用的CGM培養基，擴增子測序顯示CGM富集條件下相對豐度>1%的細菌菌群僅歸屬到3個科，包括瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)和Clostridiaceae_1(圖1-a)。其中梭菌科微生物Clostridiaceae_1是此種富集培養條件下得到的相對豐度最高的類群，豐度達到了79.33%，菌群結構較為單一(圖1-a)。自然條件下的微生物通常生活在營養缺乏,較為嚴苛的環境下，這些微生物在營養豐富,含有大量碳源、氮源的條件下則有可能難以生長，較為貧瘠的培養條件則有可能獲得更多的物種多樣性[20-21]。以此為基礎，去除速效性碳源(葡萄糖)的NBM培養基被選擇用來對窖泥菌群進行富集培養。NBM富集條件下相對豐度>1%的細菌菌群歸屬到6個科，包括消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Family_ⅩⅢ、Clostridiaceae_1和Family_Ⅺ_o_Clostridiales(圖1-b)，其中梭菌綱微生物在富集菌群中仍占主導地位，比如Clostridiaceae_1和Family_Ⅺ_o_Clostridiales相對豐度分別達到了21.60%和45.15%(圖1-b)。結合之前的研究報道，釀造體系中的產己酸丁酸菌多屬于梭菌[3-4, 22-23]，可在營養豐富的條件下富集，而NBM培養基中含有共計11 g/L的速效氮源成分，這或許是梭菌綱微生物仍在菌群結構中占比較高的原因。隨后，我們采用不含速效碳源葡萄糖且將氮源質量濃度(2 g/L)進一步降低的MCI培養基來富集窖泥菌群。如圖1-c所示，MCI培養基富集培養條件下，科水平檢測到的菌群數量明顯增加，達到15個科，其中古菌2個科、細菌13個科。采用MCI培養基培養時，除常見梭菌科微生物外，其他窖泥微生物也明顯富集，如甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、纖維桿菌科(Fibrobacteraceae)和norank_c_BRH-C20a科是富集菌群中主要的主導菌群，相對豐度分別為10.90%、27.98%、15.10%和11.97%。上述結果表明，不含葡萄糖、降低氮源的寡營養條件有利于窖泥菌群的富集，且能同時富集出細菌和古菌。

a-CGM富集菌群科水平結構;b-NBM富集菌群科水平結構;c-MCI富集菌群科水平結構圖1 不同培養基富集條件下科水平群落結構組成Fig.1 Microbial community structures at family level under different enrichment culture conditions 注：相對豐度<1%的科合并到未分類序列

2.2 MCI培養基富集時序進程中的菌群動態變化

由圖1可知，在MCI培養基富集條件下，所得到的菌群結構中包括產甲烷古菌。為進一步分析MCI培養基富集過程中的菌群動態變化，分別接種來源于某濃香型酒廠不同窖池窖泥R1和R2，窖齡分別為4和10年，作為生物學重復。基于擴增子測序技術對2個生物學重復窖泥樣本在時序進程中的菌群變化進行分析。在MCI富集培養下，2個生物學重復的富集樣品中各自檢測得到27和32個原核生物科。其中有17個科在2個樣品中都能檢測到。因富集培養的窖泥接種質量濃度100 g/L，在本研究中，某成功富集科(family)被定義為在任一生長階段的富集體系中不低于其在對應窖泥中相對豐度的10%的科。如圖2所示，在窖泥樣品和任意富集樣本中相對豐度為1%及以上的科被篩選顯示出來。

對于生物學重復1，窖泥中相對豐度為1%及以上的科為16個，包括普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Dysgonomonadaceae、Cloacimonadaceae、Family_XI_o__Clostridiales、Family_XIV、太陽桿菌科(Heliobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、互營單胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Gracilibacteraceae、unclassified_c__Clostridia、Synergistaceae、Acholeplasmataceae、unclassified_Bacteria、甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)和甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)。除甲烷桿菌科、Cloacimonadaceae、Family_XIV和互營單胞菌科4個科外，其他科均被成功富集出來，富集有效性為75%(12/16)。窖泥中相對豐度<1%的6個科，包括Clostridiaceae_1、消化球菌科、Methanomethylophilaceae、Lachnospiraceae、norank_p__Armatimonadetes和氨基球菌科(Acidaminococcaceae)，也被成功富集。此外，還有5個科包括芽孢桿菌科(Bacillaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、Oligosphaeraceae，在窖泥中的豐度低于擴增子測序檢測限，在窖泥中甚至無法檢出，但仍可被富集出來，其中Oligosphaeraceae在富集中相對期樣品中豐度甚至達到10.57%。

圖2 窖泥菌群經MCI培養基富集后在不同階段原核微生物菌群結構與種泥原核微生物菌群結構比較Fig.2 Comparation of microbial dynamics in typical enrichment cultures at different stages using MCI medium and the microbial community structure in pit muds at family level 注：相對豐度<1%的科合并到未分類序列。R1表示窖泥樣本1;R2表示窖泥樣本2;4、8和12 d等表示富集的培養天數;取樣為連續取樣

對于生物學重復2，窖泥中相對豐度為1%及以上的科為8個，包括Dysgonomonadaceae、norank_o__DTU014、動性球菌科(Planococcaceae)、互營單胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Thermoanaerobacteraceae、太陽桿菌科(Heliobacteriaceae)、甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)。其中，Dysgonomonadaceae、互營單胞菌科和太陽桿菌科被成功富集，富集有效性為37.5%(3/8)。而窖泥中相對豐度<1%的13個科，包括理研菌科(Rikenellaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、Clostridiaceae_1、Clostridiales_Incertae_Sedis、Family_XIII、Gracilibacteraceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、SRB2、Family_XI_o__Clostridiales、甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)和Methanomassiliicoccaceae，均被成功富集。此外，還有11個科為窖泥中幾乎檢測不到的低豐度微生物，包括Bacteroidales_UCG-001、Cloacimonadaceae、纖維桿菌科(Fibrobacteraceae)、norank_c__BRH-c20a、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、Oligosphaeraceae、norank_c__Berkelbacteria、norank_o__Candidatus_Moranbacteria、unclassified_Bacteria和Pedosphaeraceae，也被成功富集，其中norank_o__Candidatus_Moranbacteria在富集中期最高相對豐度達到15.06%。

上述富集分析表明，采用不同的窖泥作為種泥，使用MCI培養基進行培養均可富集到多樣性較高的菌群，富集得到的厭氧菌類型與初始窖泥微生物種類有關。而且使用這種寡營養的培養方式不僅可以富集到窖泥中豐度較高的微生物，還能富集到窖泥中的低豐度微生物。這在其他環境微生物的富集培養研究中也得到類似印證，如MU等[24]通過使用海水為主要基質的寡營養培養基對海洋微生物進行培養過程中發現富集培養可有效提高難培養微生物的豐度，從而達到檢測閾值，提高富集菌群的物種多樣性。同時，應該注意到在富集過程中菌群結構發生的動態變化，如有些微生物在富集中期或后期相對豐度高于其他時期，比如生物學重復1富集樣品中的Thermoanaerobacteraceae和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)以及生物學重復2窖泥富集樣品中的Cloacimonadaceae、纖維桿菌科(Fibrobacteraceae)和norank_o__Candidatus_Moranbacteria。這種現象也發生在其他類型環境微生物的富集培養研究中[24-25]。在富集過程中，微生物結構并非一成不變，說明在后續分離純菌株的過程中，需要特別注意在不同生長階段，目標菌可能具有不同的豐度，并關注富集過程中的時間依賴效應。

由圖2可知，在MCI富集培養條件下，R1窖泥樣品中甲烷菌群比例占原核菌群的19.26%，主導甲烷菌群為甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae，占比2.31%)和甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae，占比16.31%)；而在富集培養體系中，甲烷菌群比例僅為7.95%～9.85%，且主導甲烷菌變為甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae，占比4.62%～8.23%)。R2窖泥樣品中甲烷菌群比例占原核菌群的62.76%，主導甲烷菌為甲烷桿菌科(34.31%)和甲烷微菌科(28.11%)；而在富集培養體系中，甲烷菌群比例下降至3.30%～4.89%，主導甲烷菌是甲烷八疊球菌科(1.92%～3.17%)。富集樣品的甲烷菌種類及豐度都與窖泥中的甲烷菌有差異，碳源類型與厭氧程度可能是導致這種差異的原因。本研究采用MCI培養基的最初目的為獲得產甲烷菌群，但卻意外發現采用該培養基同時可以富集得到豐富度較高的細菌菌群。之前的多項研究表明，梭菌綱微生物在窖泥微生物菌群中占據重要地位[26-27]，傳統的實驗室培養方法也更傾向于得到高豐度的梭菌綱微生物，但得到的菌群結構較為單一[2-3]。而在本研究中，2個生物學重復富集樣品中分別檢測到11和15種梭菌綱微生物，包括太陽桿菌科(Heliobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、互營單胞菌科(Syntrophomonadaceae)、Lachnospiraceae、Clostridiaceae_1、Family_XI_o__Clostridiales、Gracilibacteraceae、消化球菌科(Peptococcaceae)、unclassified_c__Clostridia、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、Family_XIV、norank_o__DTU014、Clostridiales_Incertae_Sedis、SRB2和Thermoanaerobacteraceae，所占比例范圍分別為22.13%～25.43%(生物學重復1)、18.84%～51.63%(生物學重復2)。此外，在富集樣品中也檢測到了采用CGM培養基和NBM培養基未能成功富集的擬桿菌門(Bacteroidetes)微生物，如生物學重復1富集樣品中的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和Dysgonomonadaceae，所占比例達到16.55%～43.08%；生物學重復2富集樣品中的Bacteroidales_UCG-001、Dysgonomonadaceae和理研菌科(Rikenellaceae)，所占比例達到33.87%～42.71%。此前有研究表明，擬桿菌門屬于對營養需求較低的菌群[28-29]，與CGM(碳源20 g/L，氮源20 g/L)、NBM(氮源11 g/L)培養基相比，MCI培養基的有機營養成分(氮源2 g/L)較少，這或許符合了窖泥原位環境中某些寡營養菌群的營養需求。亦有研究表明，寡營養培養條件可培養出未培養的、多樣性更豐富的微生物[30-31]，或許正是因為這種寡營養條件抑制了優勢生長菌，如利用葡萄糖等速效碳源生長的微生物，促使更多種類的難培養微生物得以被富集。

2.3 宏基因組學分析典型富集菌群組成

通過宏基因組測序技術對典型富集樣品(生物學重復1)進行進一步的菌群結構分析。如圖3所示，在域水平，相對豐度>1%的類群中，73.06%屬于細菌，26.67%屬于古菌。而擴增子分析顯示，富集樣品中古菌菌群比例僅為8.68%，這表明使用針對16S rRNA基因V4可變區的515FmodF/806RmodR引物進行擴增子分析可能低估了古菌的豐度。在門水平，擴增子測序可將菌群歸屬到擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、廣古菌門(Euyarchaeota)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、變形菌門(Proteobacteria)、互養菌門(Synergistetes)和未分類門unclassified_Bacteria，而宏基因組測序技術并未檢測到黏膠球形菌門(Lentisphaerae)。在科水平，宏基因組學分析結果顯示所得序列僅可歸屬到11個科，少于擴增子測序的分析結果(17個科)。其中，在宏基因組測序結果中，甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae，20.09%)和紫單胞菌科(Porphyromonadaceae，17.53%)為主要的主導菌群；擴增子分析結果顯示，富集樣品中的主導菌群為Dysgonomonadaceae(25.15%)和理研菌科(Rikenellaceae，13.53%)，而主導甲烷菌甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)最高相對豐度僅可達到6.76%，遠低于宏基因組學分析結果，再次表明擴增子測序低估了古菌菌群的豐度。此外，值得注意的是，隨著分類水平的提高，宏基因組和擴增子測序的未分類序列(others)的比例都越來越高，其中在科水平，宏基因組測序的未分類序列比例高達34.33%，這是由于窖泥中的大部分細菌和古菌尚未在全基因組水平得到鑒定，目前的宏基因組學數據庫對于窖泥微生物基因組結構的解析度非常有限。

a-宏基因組域水平群落結構;b-擴增子測序域水平群落結構;c-宏基因組門水平群落結構; d-擴增子測序門水平群落結構;e-宏基因組科水平群落結構;f-擴增子測序科水平群落結構圖3 富集樣品擴增子測序與宏基因組域水平、門水平和科水平的菌群結構比對Fig.3 Comparison of the microbial compositions of a typical enrichment culture between 16S rRNA gene amplicon sequencing and metagenomic sequencing at domain, phylum and family levels 注：相對豐度<1%的菌群合并到未分類序列

用宏基因組數據對富集菌群物種信息進行注釋，如表1所示。

表1 宏基因組學解析富集樣品中微生物種水平結構Table 1 Microbial structure of a typical enrichment culture at species level by metagenomics

相對豐度>0.5%的菌群可注釋到15個物種，其中有4種產甲烷古菌得到注釋，占地22.34%，并可確定富集樣品中的主體產甲烷菌為Methanosaetaconcilii(19.62%)。除此之外，得到注釋的細菌比例僅為23.92%，而未得到分類注釋的序列比例高達53.75%，包括部分未知的古菌和大量的細菌。因此依靠宏基因組技術雖然可以獲得部分物種信息，但由于未培養微生物大量存在，而注釋用的數據庫信息不完善，對物種信息注釋和功能研究不可避免地造成阻礙[7]。今后的窖泥微生物研究仍然需要重點分離與解析未培養古菌和細菌的基因組結構。本研究建立的寡培養方法為全面解析窖泥微生物的種類構建起從免培養技術到可培養技術的橋梁。

3 結論

本研究確立了寡營養方法為富集未培養白酒釀造微生物菌群的較優方式，這種培養方式不僅可以有效維持和培養窖泥原位菌群，而且使一些低豐度菌群也得到富集。本研究建立的寡培養方法適用于除己酸菌和丁酸菌以外的未培養窖泥微生物的可培養化研究。結合本研究建立的寡培養技術，對富集菌群進行宏基因組分析，可以得到部分準確的物種注釋信息，提供了深入探索窖泥微生物釀造功能的技術手段。后續研究需進一步對窖泥微生物的可培養技術進行深入研究，以突破高通量測序的技術局限，更加準確地對白酒釀造窖泥微生物進行物種注釋，從而解析窖泥厭氧菌的釀造功能和產風味功能，為提高窖泥依賴型白酒品質的厭氧微生物應用技術提供理論支撐。