美國豆芋塊莖提取物有效成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

陳镠，盧路路，鄧珂，許光治，張有做，倪勤學(xué)

(浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州，311300)

美國豆芋 (ApiosamericanaMedikus) 為多年生豆科土圞兒屬植物[1]，別名美國花生、菜豆，地下塊莖作為無性繁殖或食用，是天然的高蛋白、高鈣食品[2-3]。美國豆芋具有抗腫瘤、抑制高血壓[4]和降低患癌風(fēng)險[5-6]等特殊功效，是一種用途廣泛的保健食品原料。美國豆芋原產(chǎn)于北美洲，后流傳至日本，于2009年成功引種至中國，經(jīng)推廣在浙江省杭州、溫州、金華和寧波等地區(qū)有栽培種植。國內(nèi)對其研究主要分析了美國豆芋生理生化特性[7-8]；國外對美國豆芋的研究更為深入，不僅對營養(yǎng)成分方面有所探索，發(fā)現(xiàn)了具有抗糖尿病、調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)等功能的DDMP-皂苷[9]，也對其降血壓降血糖方面進(jìn)行研究，研究表明美國豆芋具有降血糖、降血壓的功效[10]。歐美及日本民間就有飲用美國豆芋花茶來預(yù)防高血壓、高血糖等現(xiàn)代疾病的習(xí)慣。本課題組前期比較了美國豆芋莖、葉和花等地上部位的有效成分含量及α-葡萄糖苷酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)美國豆芋花具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性[11]。本試驗在前期研究的基礎(chǔ)上，對美國豆芋塊莖的有效成分含量、抗氧化以及α-葡萄糖苷酶抑制能力進(jìn)行探究，篩選出最佳活性部位，以期為美國豆芋資源的高效利用以及美國豆芋塊莖作為抗氧化劑和降血糖降血脂功能性食品原料的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美國豆芋塊莖于2018年9月采收于浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學(xué)平山試驗基地，洗凈切片，晾干，粉碎，過40目篩，得美國豆芋塊莖粉，備用。

葡萄糖、鹽酸小檗堿、染料木苷、熊果酸，α-葡萄糖苷酶，上海源葉生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，BBI Life Sciences公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(2,4,6-tri (2-pyridyl)-1,3,5-triazine,TPTZ)，北京百靈威試劑有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)，Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

SHB-Ⅲ-A型循環(huán)水式多用真空泵，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；IKA RV 3eco型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡儀器有限公司；UV-5500型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Multiskan spectrum型全波動酶標(biāo)儀，Thermo fisher Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 化學(xué)成分定性、定量分析

參考陳玉婷等[12]和郝海燕等[13]方法，將美國豆芋塊莖按照不同的方法(顏色反應(yīng)和沉淀反應(yīng))進(jìn)行化學(xué)成分的快速定性分析。

1.2.2 美國豆芋塊莖提取物制備

精密稱取美國豆芋塊莖粉200 g，按料液比1∶3(g∶mL)分別用石油醚、甲醇、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇和蒸餾水提取，每種溶劑提取3次，合并提取液，減壓濃縮干燥，得石油醚提取物、甲醇提取物、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取物和水提取物。計算得率和含量。

(1)

式中:m1,提取后美國豆芋塊莖質(zhì)量,g;m2,美國豆芋塊莖粉末質(zhì)量,g。

甲醇提取物用水溶解，采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，每種溶劑萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮干燥，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。計算得率和含量。

(2)

式中:m1,提取后美國豆芋塊莖質(zhì)量，g；ρ,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的提取液樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；V,定容體積，mL。

1.2.3 有效成分含量測定

總生物堿的測定方法參考文獻(xiàn)[14];總糖的測定方法參考文獻(xiàn)[15];總皂苷的測定方法參考文獻(xiàn)[16];總黃酮的測定方法參考文獻(xiàn)[17];異黃酮的測定方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.2.4 體外抗氧化活性測定

DPPH自由基活性測定參考文獻(xiàn)[19];ABTS陽離子自由基活性測定參考文獻(xiàn)[20-21];總抗氧化能力測定參考文獻(xiàn)[22-23],采用ferric reducing ability of plasma (FRAP)法測定。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定參考文獻(xiàn)[24-25]。

1.3 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，圖形繪制用Origin 9.0制圖。所有試驗重復(fù)3次后取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 美國豆芋塊莖化學(xué)成分定性、定量分析

根據(jù)化學(xué)顯色法，定性、定量分析美國豆芋塊莖中的化學(xué)成分，結(jié)果見表1。由表1可知，美國豆芋塊莖中含有生物堿類、黃酮類、皂苷類和糖類等化學(xué)成分。化學(xué)定量分析結(jié)果表明，美國豆芋塊莖活性成分中總糖含量為0.85%，可能是淀粉類物質(zhì)較多；總黃酮含量為0.44%，異黃酮含量為0.88%，其黃酮含量略低于銀杏葉[26](2.4%)和竹葉[27](2.73%)中黃酮含量；其異黃酮含量較秦巴山區(qū)粉葛[28](0.68%)、黑豆[29](0.595%)和大豆[30](0.394%)中異黃酮含量高。目前異黃酮來源主要依靠于大豆，美國豆芋塊莖中異黃酮含量是大豆的近3倍，因此，美國豆芋塊莖可作為1種新型異黃酮來源食物；生物堿和皂苷含量較低，其皂苷含量比黨參皂苷[31](1.638%)低了近1/5。

表1 美國豆芋塊莖化學(xué)成分定性定量分析Table 1 Qualitative and quantitative analysis of chemical composition of Apios americana Medikus

2.2 美國豆芋塊莖不同提取物有效成分含量

采用紫外分光光度法對美國豆芋塊莖石油醚提取物、甲醇提取物、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取物和水提取物的有效成分進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，利用不同極性溶劑來提取美國豆芋塊莖中的有效成分，水提取物的得率較高，說明美國豆芋塊莖中可能存在大極性物質(zhì)，如淀粉等；水提取物總糖含量占比也證實了這一點。生物堿在體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取物中含量最高。甲醇提取物中總皂苷、總黃酮和異黃酮含量均顯著高于其他提取物(P<0.05)。

表2 美國豆芋塊莖不同提取物有效成分含量 單位:%

2.3 美國豆芋不同提取物抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性

利用不同的體外抗氧化體系，對美國豆芋塊莖石油醚提取物、甲醇提取物、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取物和水提取物的抗氧化活性進(jìn)行測定，同時測定其α-葡萄糖苷酶抑制活性能力，結(jié)果見表3。

表3 美國豆芋塊莖不同提取物抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Table 3 Antioxidant properties and α-glucosidase activity of different extracts of Apios americana Medikus tuber

在一定線性范圍內(nèi)，美國豆芋塊莖不同提取物溶液的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率與其自身質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，先上升后趨于穩(wěn)定。美國豆芋塊莖不同提取物的抗氧化活性順序為：VC>甲醇提取物>體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取物>水提取物>石油醚提取物。對比美國豆芋花醇提物的抗氧化能力[32](DPPH自由基清除IC50為861.25 mg/L，ABTS陽離子自由基清除IC50為69.92 mg/L，F(xiàn)RAP值為929.06 mmol/L)，美國豆芋塊莖甲醇提取物表現(xiàn)出更高的活性。甲醇提取物抗自由基活性顯著高于其他提取物(P<0.05)，DPPH自由基清除能力的IC50為356.602 μg/mL，ABTS陽離子自由基清除能力的IC50為30.051 μg/mL。4個不同極性提取物中，甲醇提取物和體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制無顯著性差異，石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力表現(xiàn)一般，水提取物未表現(xiàn)出α-葡萄糖苷酶活性抑制。

2.4 美國豆芋塊莖甲醇提取物不同分極相有效成分含量

由上述結(jié)果可知，美國豆芋塊莖甲醇提取物的抗氧化(DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力)活性明顯強于其他提取物(P<0.05),甲醇提取物和體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制無顯著差異(P<0.05)。綜合考慮后對甲醇提取物進(jìn)一步分離萃取得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。由表4可知，甲醇提取物不同分極相中正丁醇相得率最高，可能是糖類和生物堿類物質(zhì)較多。乙酸乙酯相中總皂苷、總黃酮和異黃酮含量與其他分極相存在顯著差異(P<0.05)，因此，在提取美國豆芋豆芋塊莖中總皂苷和黃酮類物質(zhì)時，可選擇乙酸乙酯作為萃取劑，提高提取率。

表4 美國豆芋塊莖甲醇提取物不同分極相有效成分含量 單位:%

2.5 美國豆芋甲醇提取物抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性

由表5可知，甲醇提取物不同分極相的抗氧化活性順序：VC>乙酸乙酯相>石油醚相>正丁醇相>水相。乙酸乙酯相的DPPH自由基清除能力的IC50值為55.573 μg/mL，ABTS陽離子自由基清除能力的IC50值為4.543 μg/mL，F(xiàn)RAP值為50.134 μmol/mg。陳石梅等[33]研究草果醇提物不同極性部位的抗氧化活性順序與本文相同，乙酸乙酯相表現(xiàn)出最強的抗氧化活性。甲醇提取物不同分極相中，乙酸乙酯相表現(xiàn)出較強的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力(IC50值為430.042 μg/mL)。邱珊蓮等[34]探究嘉寶果嫩葉提取物不同極性部位的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯相(IC50值為8.375 8 g/L)和正丁醇相(IC50值為16.894 3 g/L)的抑制活性最佳。

表5 美國豆芋塊莖甲醇提取物不同分極相抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Table 5 Different fractional phase antioxidant and α-glucosidase activity of methanol extract from Apios americana Medikus tuber

2.6 抗氧化和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的與有效成分的相關(guān)性分析

考察美國豆芋塊莖甲醇提取物不同分極相中有效成分含量與抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的相關(guān)性，結(jié)果見表6。由表6可知，通過相關(guān)性分析，DPPH自由基清除能力與總糖和總皂苷相關(guān)性較大，ABTS陽離子自由基清除能力和生物堿和總糖相關(guān)性較大。由此可見，總糖和總皂苷對清除DPPH自由基有著重要作用，ABTS陽離子自由基清除能力主要與生物堿和總糖有關(guān)。Fe3+還原力與總糖相關(guān)性較大。α-葡萄糖苷酶活性抑制能力主要與總糖、總皂苷、總黃酮和異黃酮相關(guān)，美國豆芋塊莖具有較強的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力是其有效成分綜合作用所致。美國豆芋醇提物乙酸乙酯含有較多的總生物堿、總皂苷和黃酮類物質(zhì)，說明美國豆芋塊莖醇提物乙酸乙酯相是挖掘抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性物質(zhì)的主要極性部位。

表6 抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力與有效 成分的相關(guān)性分析 單位:%

3 結(jié)論

美國豆芋塊莖中含有豐富的生物堿、總糖、皂苷、黃酮和異黃酮等有效成分。美國豆芋塊莖甲醇提取物乙酸乙酯相中總皂苷(5.30%)、總黃酮(13.22%)和異黃酮(15.89%)含量最高，抗氧化活性(DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力的IC50值分別為55.573和4.543 μg/mL，F(xiàn)RAP值為50.134 μmol/mg)及α-葡萄糖苷酶抑制活性最強(IC50值為430.042 μg/mL)。相關(guān)性分析表明，美國豆芋塊莖醇提物乙酸乙酯相是挖掘抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性物質(zhì)的主要極性部位。本文為美國豆芋資源的高效利用以及美國豆芋塊莖作為天然抗氧化劑和降血糖降血脂功能性食品原料的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。