基于電子鼻、氣-質聯用技術和感官評價方法優化海帶發酵脫腥工藝

顧賽麒，胡彬超，張月婷，鮑嶸斌，王蘇寧，鄒琳，周緒霞，丁玉庭*，欒露琴，張晨超，唐文燕

1(寧海縣浙工大科學技術研究院，浙江 寧海,3156001) 2(浙江工業大學 食品科學與工程學院，浙江 杭州,310014) 3(國家遠洋水產品加工技術研發分中心(杭州)，浙江 杭州,310014)

海帶(Laminariajaponica)是我國重要的海水養殖品種，2018年全國養殖總量已達152.3萬 t[1]。海帶營養成分豐富，但自身腥味較重，對其食用品質可能造成不利影響[2-3]。海帶腥味物質主要包括醛類、醇類、烯酮類、有機溴代物或碘代物等[4-6]。目前，海帶脫腥方法可分為物理法、化學法和生物法[7]，其中生物法具有脫腥效率高、工藝條件溫和等優點，應用最為廣泛，具體機理是：在微生物的作用下，小分子的腥味物質經合成、轉化或結構修飾等作用，最終成為無腥味成分。據報道，酵母菌是最常用的發酵菌種，其脫腥效果較好[8]。

在酵母法脫腥過程中，酵母濃度、發酵溫度和發酵時間等因素對海帶脫腥效果影響顯著。酵母菌初始濃度過低或者發酵時間過短，可能導致腥味物質消降不完全；反之，則可能造成菌體大量增加，引入菌體異味而導致風味品質下降。此外，隨著發酵時間的延長，發酵過程中產生的酸類物質(H2CO3等)不斷積累，使發酵液pH顯著下降，影響酵母菌活性。同時，若發酵溫度過高或過低也會對酵母菌活性造成影響，進而影響最終脫腥效果[8]。

現階段對海帶脫腥的常用評價手段有感官評價、電子鼻和氣相色譜-質譜聯用。感官評價能客觀反映消費者對樣品的接受度或喜好性，但易受人員因素的影響[9-10]。電子鼻可區分不同樣品氣味輪廓的細微差異，但無法對樣品中的某一揮發性成分進行鑒別[11-12]。氣相色譜-質譜聯用是最常用的揮發性風味分析手段，其結果與使用的前處理技術密切相關。整體材料吸附萃取作為一種逐漸興起的前處理技術，基于硅膠、活性炭和十八烷基硅烷等材料為一體的高交聯性新型吸附劑，對不同極性和沸點的化合物均能實現有效吸附，適用范圍較廣[13]。上述3種評價手段各有利弊，本研究嘗試將其聯用后優化海帶發酵脫腥工藝，旨在為海帶制品生產企業提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，2017年3月購自杭州近江水產市場；安琪耐高溫釀酒高活性干酵母(貨號：E80000012)，河南洲洋生物科技有限公司；葡萄糖、NaCl、無水乙醇(均為分析純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；2,4,6-三甲基吡啶標準品、C6～C15正構烷烴標準品(均為色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

FA 3204B電子分析天平，上海儀天科學儀器有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器，上海越眾儀器設備有限公司；LRH-350F生物培養箱，常州市金壇勒普儀器有限公司；RCC18固相萃取整體捕集劑(規格2.9 mm×5 mm，孔徑1 mm)，日本GL Sciences公司；7890A/5975C單四級桿氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司；Fox4000型電子鼻，法國阿爾法莫斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫腥處理

酵母活化液制備：稱取10 g葡萄糖和0.3 g NaCl充分溶解于1 000 mL去離子水中，分別向其中加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g釀酒酵母干粉，配成質量濃度梯度為0.5、1、1.5、2和2.5 g/L的酵母菌液，將上述系列菌液置于25 ℃、120 r/min的恒溫搖床中活化20 min，所得活化液中酵母菌數分別為7.86、8.14、8.32、8.46和8.56 lg CFU/g。

海帶脫腥工藝：將海帶剪成1 cm×1 cm左右、大小均一的小塊。稱取10 g海帶樣品，裝入內裝100 mL酵母活化液的具塞錐形瓶中，置于轉速為120 r/min的恒溫搖床中，分別于不同溫度下(24、26、28、30和32 ℃)脫腥不同時間(30、60、90、120和150 min)。脫腥完畢的海帶洗凈后用吸水紙吸干表面，混合均勻后待測。

1.3.2 電子鼻分析

稱取2.00 g海帶樣品，裝入10 mL頂空瓶中，采用FOX4000型電子鼻進行測定。儀器參數：平衡溫度60 ℃，平衡時間600 s，進樣速度2 000 μL/s，進樣體積2 000 mL，載氣為潔凈空氣，流速150 mL/min，數據采集周期600 s。每個樣品重復測定5次。

1.3.3 整體材料吸附萃取-氣相-質譜分析

稱取2.00 g海帶樣品，裝入15 mL頂空進樣瓶中。將5個RCC18空心圓柱體吸附子以固定裝置相連，置于頂空瓶中樣品正上方。將頂空瓶放入60 ℃恒溫水浴鍋中萃取50 min，待萃取完畢后手動取出吸附子裝入熱脫附管，送入熱解析單元中熱脫附進樣。每個樣品重復測定3次。

熱解析單元：不分流模式，初始溫度40 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。為防止進樣量較大引起的峰形變形，配制了液氮冷阱系統：初始溫度-40 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留15 min。

GC條件：DB-5 MS毛細管柱(60 m×0.32 mm, 1 μm)，汽化室溫度240 ℃。柱溫起始40 ℃，以4 ℃/min升至100 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。載氣流量1.2 mL/min。MS條件：EI能量源；電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z35～450，離子源溫度220 ℃，傳輸線溫度250 ℃。

定性、定量方法：將揮發物質譜圖與NIST 2014譜庫進行比對，僅報道正反匹配度均>800的鑒定結果，同時計算各個揮發物的線性保留指數(linear retention index，LRI)，將其與文獻中的數值進行比對后定性[14]。在海帶樣品中加入10 μL質量濃度為10-5g/mL的內標物2, 4, 6-三甲基吡啶，通過計算待測揮發物與內標物峰面積的比值來求得各揮發物的質量濃度。

1.3.4 感官評價

采用劃線法[15]對海帶整體氣味可接受度進行評分。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 17.0軟件和Origin 8.0軟件進行處理分析，差異顯著性分析由最小顯著差數法完成。

2 結果與分析

2.1 電子鼻技術分析不同發酵工藝對海帶腥味脫除的影響

圖1～圖3中第1與第2主成分貢獻度之和均>90%，表明經不同條件發酵后，海帶樣品整體氣味輪廓差異均十分顯著，樣品信息損失率<10%。判別指數主要用于評定不同組樣品數據點間的區分程度，最大值為100，其值越大表明區分效果越好[8]。圖1～圖3判別指數均在84以上，表明經不同發酵條件處理后，海帶樣品整體氣味輪廓均無重疊，區分度較好。

圖1 不同酵母濃度處理海帶樣品電子鼻結果 主成分分析圖Fig.1 PCA plot of E-nose results ofLaminaria japonica fermented with different yeast concentrations

圖1顯示，酵母質量濃度分別在0.5、1 g/L以及1.5、2 g/L時，樣品數據點均較為接近；當酵母質量濃度達到2.5 g/L時，樣品數據點與其他濃度組間距離顯著增大，分析可能與酵母質量濃度過高引入菌體異味有關。由圖2可知，發酵溫度在24～28 ℃時，樣品各組數據點間距離較為接近；而發酵溫度>30 ℃時，樣品數據點與其他組間距離不斷增大，表明過高的發酵溫度可能對脫腥后海帶樣品氣味產生不利影響。圖3顯示，隨著發酵時間的延長，樣品數據點與原料海帶數據點間距離不斷增大，推測海帶發酵過程中腥味物質的脫除可能存在時間積累效應。此外，通過比較各組樣品數據點與原料海帶數據點質心間的平均距離，發現存在“酵母質量濃度>發酵時間>發酵溫度”的趨勢，表明酵母質量濃度可能對海帶脫腥效果存在最顯著的影響。

圖2 不同發酵溫度處理海帶樣品電子鼻結果 主成分分析圖Fig.2 PCA plot of E-nose results of Laminaria japonica fermented under different temperatures

圖3 不同發酵時間處理海帶樣品電子鼻結果 主成分分析圖Fig.3 PCA plot of E-nose results of Laminaria japonica with different fermentation time

2.2 不同發酵工藝對海帶揮發性風味物質的影響

2.2.1 海帶揮發性風味物質分析

從原料海帶中共檢測出42種化合物，其中氣味活度值(odor activity value,OAV)>1的化合物共有己醛等10種，可定義為海帶中的活性氣味物質。經不同發酵條件處理后，無論是揮發物種類、總濃度,還是OAV值總和均發生了不同幅度的下降。當酵母質量濃度為1.5 g/L時，揮發物種類從原來的42種減少為25種，總質量分數降低141.13 ng/g，OAV值總和降低36.96。當酵母發酵溫度為28 ℃時，揮發物種類減少16種，總質量分數和OAV總和降幅最大，分別為49%和40%。當發酵時間為120 min時，共有18種揮發物被消除，揮發物總質量分數和OAV總和降至最低，分別為138.88 ng/g和52.68 ng/g。綜上所述，確定海帶發酵脫腥的最優工藝條件為：酵母質量濃度1.5 g/L、發酵溫度28 ℃、發酵時間120 min。

醛類氣味閾值較低，對海帶整體氣味貢獻最為突出。經最優工藝發酵后，6種氣味活性醛類OAV值均發生了不同程度消降，其中己醛、庚醛和癸醛的消降程度較多，分別為18.77、4.30和4.62。己醛被報道是海帶的典型腥味物質，呈魚腥味、青草味等不良氣味特征[16]。除己醛外，其他直鏈醛和含不飽和鍵的烯醛也被報道是海帶中的異味物質，而苯甲醛具有苦杏仁味[17]，經發酵后它們質量分數和活性值均下降顯著。

醇類對海帶整體揮發性風味有重要影響。經最優工藝發酵后，醇類總質量分數和OAV值總和下降近50%，其中3種不飽和烯醇貢獻較顯著：1-戊烯-3-醇和2-辛烯-1-醇的消降率達100%，而1-辛烯-3-醇被報道是海帶中典型的腥味物質(呈魚腥味和青草味)[18]，發酵后其OAV消降值達3.51，占醇類消降量的46%。段吳勇[19]報道，酵母發酵后海帶中醇類物質種類顯著減少、濃度大幅下降，與本研究結果一致。

酮類是海帶中常見的風味組分，經最優工藝發酵后，2-庚酮、1-辛烯-3-酮、3-辛酮和苯乙酮這4種酮類被完全消除，占所有酮類總數的一半。1-辛烯-3-酮是原料海帶中濃度最高的酮類物質，呈典型的魚腥味，有研究者證實海帶發酵后1-辛烯-3-酮的脫除率為100%[19]。原料海帶中僅有2-庚酮具有氣味活性，在發酵海帶中未被檢出。總體而言，酮類化合物因其OAV值總和較低，故對海帶整體氣味貢獻不大[20]。

芳香類主要來自于海泥和水體等外部環境，通過生物富集作用在海帶中積累，一般具有刺激性和石油味等不良風味。采用最優工藝發酵后，海帶中芳香類的OAV值總和顯著下降(達2.45)，其中聯苯作為該類唯一的氣味活性物質貢獻顯著，占芳香類OAV總消降值的82%。

烴類因其自身閾值較大，故對海帶揮發性風味貢獻較小。2-乙基呋喃屬含氧雜環類化合物，具有刺激性氣味，是海帶中另一種重要的氣味活性物質，經發酵后的海帶中，其濃度已降至降至閾值以下，不具氣味活性。三碘甲烷是原料海帶中唯一被檢出的含碘化合物，采用最優工藝發酵后其未被檢出。

2.2.2 脫腥處理中海帶中氣味活性物質變化

由附表1(kns.cnki.net/KCMS/detail/11.1802.TS.20200715.1751.008.html)和圖4可知，經不同脫腥工藝處理后，海帶中10種氣味活性物質的OAV消降值和消降率均>0，表明經酵母發酵后，海帶自身氣味活性發生了降低。除2-辛烯醛和壬醛之外，其余8種氣味活性物質的OAV消降效果均較為顯著，其中己醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的OAV消降值較大(最大消降值均>3，其中癸醛達18以上)，而己醛、庚醛、癸醛、2-庚酮和2-乙基呋喃的消降率較高(最高消降率均>40%，其中2-庚酮達100%)。總體而言，原料海帶經不同發酵條件處理后脫腥效果均較好，但其中也存在一定差異性。比較圖4-a和圖4-d可知，當酵母質量濃度為1.5 g/L時，發酵后海帶樣品的OAV消降值及消降率均最高，表明其脫腥效果最好；由圖4-b和圖4-e可知，當發酵溫度為28 ℃時，海帶脫腥效果最佳；由圖4-c和圖4-f可知，當發酵時間為120 min時，海帶腥味消減最顯著。

a-酵母質量濃度對OAV消降值的影響;b-發酵溫度對OAV消降值的影響;c-發酵時間對OAV消降值的影響;d-酵母濃度對OAV 消降率的影響;e-發酵溫度對OAV消降率的影響;f-發酵時間對OAV消降率的影響圖4 不同脫腥工藝對海帶氣味活性物質的OAV消降值的影響Fig.4 Effect of different deodorization processes on the OAV of Laminaria japonica 注：小寫字母不同代表各組數據間具有顯著性差異(P<0.05)

2.3 脫腥處理后感官評分

酵母質量濃度1.5 g/L時，海帶樣品感官評分升至最高的70.5分，此質量濃度下，脫腥后海帶中揮發物的總質量分數與OAV值總和均達最低值(146.42和54.79 ng/g)。主要原因可能是：0～1.5 g/L時，酵母質量濃度逐漸升高，發酵作用逐步加強，海帶中的腥味物質消降效果越顯著；但當酵母質量濃度>1.5 g/L，則可能引入不良發酵異味，導致感官評分下降。

發酵溫度28 ℃時，脫腥后海帶感官評分達到最高，而此溫度下脫腥后海帶樣品揮發物總濃度值和OAV總和均低于其他溫度組。分析原因是：在24～28 ℃時，酵母增殖速度隨溫度增大，海帶中的腥味物質可能發生結構破壞或者經生物合成、修飾等反應導致其腥味特征消失；當溫度繼續升高至30 ℃(酵母菌的最適生長溫度)時，菌體可能大量增殖引入不良異味[21]，造成海帶樣品感官評分下降。

發酵時間120 min時，感官評分達到最大值，而揮發物總質量分數和OAV總和達到最小值，兩者可相互印證。在30～120 min內，酵母菌快速增殖，腥味物質經消降或生物轉化作用而減少。隨著發酵時間達到150 min，增殖逐步進入穩定期，菌體數量大量積累，酵母菌體與生成的次生代謝產物均可能造成海帶中異味物質的增加，造成感官評分下降。

綜上所述，感官評分與揮發物總質量分數以及OAV總和變化規律具有較強一致性，分析其相關性發現(表1)，不同脫腥條件下，感官評分與揮發物總質量分數以及OAV總和的相關性(分別以RAB和RAC表示)總體較高，絕對值均>0.8，且存在|RAB|<|RAC|的規律，表明與揮發物質量分數相比，OAV值與感官評分間的相關性更強。此外，無論是RAB還是RAC，均存在發酵時間>發酵溫度>酵母質量濃度的規律，表明不同發酵時間海帶樣品感官評分與揮發物總質量分數和OAV總和間的相關性最好。

表1 發酵條件對感官評價的影響及其 相關性分析Table 2 Influence of fermentation conditions on sensory evaluation and the correlation analysis

3 結論

不同發酵條件下海帶樣品整體氣味輪廓均無重疊，區分度較好。從原料海帶中共檢出7大類42種揮發物，篩選得到以己醛為代表的10種氣味活性物質。根據揮發物種類、總質量分數和OAV總和，確定了海帶脫腥的最優工藝：酵母質量濃度1.5 g/L、發酵溫度28 ℃、發酵時間120 min。所有氣味活性物中，己醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的OAV消降值較大；己醛、庚醛、癸醛、2-庚酮和2-乙基呋喃的消降率較高；2-辛烯醛和壬醛的消降效果不顯著。經最優工藝發酵后，海帶中揮發物種類減少18種，揮發物總質量分數降低148.77 ng/g，氣味活性值總和減少39.07，感官評分升至最大值70.5。無論何種發酵條件下，感官評分與OAV值總和間的相關性始終高于與揮發物總質量分數間的相關性。