充氮包裝和儲藏溫度對益生菌粉儲藏穩定性的影響

桑躍，馮海紅，蒙璐，劉力，劉作文，葛紹陽，金君華

1(北京農學院 食品科學與工程學院,食品質量與安全北京實驗室，北京, 102206) 2(河北省畜產食品工程技術研究中心，河北 三河, 065200)

2001年，聯合國糧農組織/世界衛生組織(FAO/WHO)聯合專家委員會提出了益生菌的科學定義：益生菌系指活的微生物，當攝取足夠數量時，對宿主健康有益[1]。在“健康中國”國家戰略的推動下，益生菌的市場規模快速擴大，到2018年已形成近千億元的龐大市場規模[2]。

益生菌粉(固體飲料類)是益生菌應用的主要產品形式之一，特別是近幾年的益生菌市場，益生菌粉的種類和數量如雨后春筍般增長，在市場火爆的同時，益生菌自主產權以及產品穩定性也是人們關注的深層問題，這也是衡量一個企業能否長久發展和參與國際競爭的核心因素。

本文所研究的2株益生菌動物雙歧桿菌A6和長雙歧桿菌BBMN68均是分離自廣西巴馬長壽老人腸道[3-4]。已有研究證明，動物雙歧桿菌A6具有降低膽固醇、增強機體免疫力和緩解小鼠便秘等多種益生功能[5]，還有較強的耐酸耐膽鹽能力[6]，有助于在腸道內存活和定植；長雙歧桿菌BBMN68是1株具有較低耐氧能力的益生菌[7]，有多篇研究報道長雙歧桿菌BBMN68具有改善小鼠腸道消化功能[8-9]、增強小鼠免疫調節能力[10-11]和提高線蟲抗衰老功能等作用[12]。

目前，動物雙歧桿菌A6和長雙歧桿菌BBMN68的工業生產技術已經完全成熟，能夠分別穩定生產出活菌數在1.0×1012和1.0×1011CFU/g以上的菌粉，這2株益生菌已完全具備產業化應用的基礎，但為了進一步提高2株雙歧桿菌菌粉的穩定性，降低菌粉的儲運成本，需要在包裝及貯藏方式方面開展系統研究，以期找到保持產品穩定性的最優方式。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

動物雙歧桿菌A6和長雙歧桿菌BBMN68均由教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室提供，其菌種專利保藏號分別為CGMCC 9273和 CGMCC 2265。

1.1.2 主要原輔料

益生菌凍干粉：動物雙歧桿菌A6菌粉(活菌數1.2×1012CFU/g)、長雙歧桿菌BBMN68菌粉(活菌數5.2×1010CFU/g)，三河福成生物科技有限公司。

輔料：低聚果糖，95型，山東百龍創園生物科技有限公司；乳清粉，D40型，Lactear S.A.；菊粉，NanoST P90型，豐寧平安高科實業有限公司；低聚半乳糖，GOS-700-P型，云浮市新金山生物科技有限公司。輔料在使用前進行烘干處理。

包材：寬度58 mm，厚度8絲，鋁箔復合膜材質，四川中金醫藥包裝有限公司。包材符合GB/T 28118—2011《食品包裝用塑料與鋁箔復合膜、袋》規定。

N2：標準氣，純度≥99.9%。

1.1.3 培養基

活菌計數培養基：MRS培養基，北京路橋技術股份有限公司。培養基按照說明配制，添加質量濃度0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽，121 ℃滅菌15 min后置于48 ℃水浴鍋內備用。

1.1.4 主要儀器與設備

LabSwift-aw便攜式水分活度儀，瑞士Novasina公司；CheckMate 3殘氧檢測儀，丹麥Dansensor公司；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DXDFZ60F全自動粉劑包裝機，北京華清三豐科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

益生菌粉配方(g/L)：低聚果糖350，乳清粉300，菊粉200，低聚半乳糖100，菌粉50。

將A6菌粉和BBMN68菌粉按照配方與輔料進行混合，以充氮和普通包裝工藝制備2種菌種的樣品，分別記為A6益生菌粉和BBMN68益生菌粉，樣品規格2 g/袋，每組樣品數量≥200袋。充氮樣品殘氧控制依據GB/T 26993—2011《奶粉定量充填包裝機》，殘氧量≤3%。包裝完成后，將樣品放置于-20、4、25和37 ℃的溫度下進行儲藏實驗，分別在0、3、6、9和12個月取樣進行檢測。

1.2.2 水分含量測定

水分含量依據GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》第一法(直接干燥法)進行測定。檢測樣品在每個取樣點分別做3次平行測定，結果取平均值。

1.2.3 水分活度測定

將待檢樣品和水分活度儀放置于22～25 ℃、空氣相對濕度30%～40%的測定室平衡1～2 h。根據水分活度儀使用說明進行測定，檢測樣品在每個取樣點分別做3次平行測定，結果取平均值。

1.2.4 活菌數測定

菌落計數依據 GB 4789.34—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢測 雙岐桿菌檢驗》中食品樣品雙歧桿菌計數方法,略作修改。稱取待檢樣1.0 g，置于裝有9.0 mL滅菌生理鹽水的離心管內，旋渦振蕩1～2 min，制成10倍稀釋度樣品勻液，然后做10倍系列梯度稀釋，選取2～3個適宜稀釋梯度，分別吸取1.0 mL樣品勻液于無菌平板內，每個稀釋度做3個平皿，及時將冷卻至46 ℃的計數培養基傾注平皿，并單方向轉動混合。待平板凝固后，倒置于厭氧培養盒內，(36±1)℃培養(48±2)h后計數。

2 結果與分析

2.1 益生菌粉儲藏過程中水分含量的變化

由表1和表2可知，2種益生菌粉隨著儲藏時間的延長，水分含量(質量分數)無明顯變化，數值均小于4%，這有助于益生菌粉的儲藏[13]。對比所有組別的水分含量，均無顯著性差異(P>0.05)，說明2種益生菌粉在儲藏過程中可保持其水分含量穩定，且不受包裝方式和儲藏溫度的影響。

表1 A6益生菌粉儲藏過程中水分含量 單位：%

表2 BBMN68益生菌粉儲藏過程中水分含量 單位：%

2.2 益生菌粉儲藏過程中水分活度的變化

由圖1和圖2可知，當儲藏溫度為-20和4 ℃時，2種益生菌粉水分活度無明顯變化；當溫度為25 ℃時，水分活度在儲藏過程中開始緩慢上升；當儲藏溫度為37 ℃時，水分活度變化顯著，A6和BBMN68益生菌粉2種包裝方式分別在第3和6個月出現顯著性差異。因此，儲藏溫度對益生菌粉水分活度的影響較大，貯藏溫度越高，水分活度變化越大，而充氮包裝可降低水分活度的波動，更好地維持產品穩定，這與賈宏信[14]的研究結果相似。同時從結果可知，儲藏條件一致時，2種益生菌粉之間無顯著性差異。

圖1 A6益生菌粉儲藏過程中水分活度的變化Fig.1 Water activity change of A6 probiotics powder during storage 注：* 表示在相同儲藏溫度下，相同儲藏時間普通包裝與充氮 包裝結果呈顯著性差異(P>0.05)(下同)

圖2 BBMN68益生菌粉儲藏過程中水分活度的變化Fig.2 Water activity change of BBMN68 probiotics powder during storage

對于益生菌類粉劑產品而言，一般要求水分活度<0.25[15-16]，在低水分活度下可減少菌體的代謝活動，延長保質期，但水分活度不是越低越好，菌體仍需要一定量的水分來維持細胞結構，水分活度<0.1時，細胞膜上的磷脂更容易被氧化，造成細胞損傷[17]。KURTMANN等[18]和VESTERLUND等[19]分別研究了嗜酸乳桿菌La-5和鼠李糖乳桿菌在不同水分活度的食品中的貯藏穩定性，得到了相同的結果，當水分活度為0.11時，菌體存活率最高。本文研究的2種益生菌粉水分活度均維持在0.1～0.13，可較好維持產品的穩定性。

2.3 益生菌粉貯藏過程中活菌數的變化

由圖3、圖4可知，在-20和4 ℃下，活菌數保持穩定，存活率維持在85%以上；當溫度為25 ℃時，活菌數隨著儲藏時間延長逐漸下降，儲藏期結束，A6和BBMN68益生菌粉充氮包裝活菌存活率分別為40.2%和32.7%，而普通包裝僅為28.0%和17.3%，差異顯著；當溫度為37 ℃時，活菌數急劇降低，儲藏12個月，充氮和普通包裝的A6益生菌粉存活率分別為0.14%和0.033%，BBMN68益生菌粉為0.094%和0.013%。因此，溫度對益生菌粉的活菌穩定性影響較大，即使在常溫下儲藏，活菌數仍會大幅度下降。

圖3 A6益生菌粉儲藏過程中的活菌數Fig.3 Survival of A6 in probiotics powder during storage

圖4 BBMN68益生菌粉儲藏過程中的活菌數Fig.4 Survival of BBMN68 in probiotics powder during storage

益生菌是活的生命體，對溫度極為敏感[20-23]。在較低溫度下，菌體處于休眠狀態，較為穩定，高溫則導致菌體內蛋白等物質變性，功能喪失。而且不同菌株性狀差異較大，導致其對高溫的耐受能力不同[24-25]。由圖3和圖4結果可知，同樣在25和37 ℃儲藏下，A6益生菌粉的存活率普遍高于BBMN68益生菌粉，說明A6菌株具有更好的耐高溫性能。

此外，細胞膜氧化反應也是影響菌體穩定性的重要因素，細胞膜主要是由磷脂雙分子層構成，而磷脂易與O2發生氧化反應，使細胞膜不完整，高溫則會加速氧化速率，促使菌體死亡。ISHIBASHI等[26]證實了益生菌在有氧條件下存活率下降，TEIXEIRA等[20]研究了益生菌粉中添加抗氧化劑有利于益生菌活菌數的保持，因此，針對含有益生菌的產品，應做到無氧包裝或增加除氧能力，以保證產品質量。圖3和圖4結果表示，在37 ℃儲藏下，不同包裝的2種益生菌粉活菌數均在第3個月出現顯著性差異，儲藏期結束時，充氮包裝使A6和BBMN68益生菌粉存活率分別提升4.2和7.2倍，保護效果極為顯著。

3 結論與展望

綜上所述，儲藏溫度是影響益生菌粉穩定性的關鍵因素，冷凍和冷藏條件可較好維持產品品質，當儲藏溫度升高至常溫及以上時，產品穩定性則隨溫度的升高顯著降低。通過改變包裝方式，證明了充氮包裝有利于益生菌粉儲藏，特別是對耐氧性較差的長雙歧桿菌，可有效改善該類益生菌在產品中的應用限制，促進益生菌粉市場的發展。

從本文研究結果可知，益生菌粉最佳儲藏條件是冷凍或冷藏，然而這在實際操作中很難實現，特別是運輸環節，不能保證全程冷鏈，且低溫運輸也意味著需要更高的成本，不利于益生菌粉市場的發展。充氮包裝方式雖可改善益生菌粉穩定性，但卻不能完全阻止益生菌死亡。所以如何提高常溫及更高溫度下益生菌粉的穩定性依舊是關注的熱點，還需深入研究。