一種滴滴涕膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

□ 萬宇平 何方洋 賈芳芳 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技術有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心

□ 鄭百芹（通信作者） 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心

引言

滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，簡稱“DDT”）是一種高毒有機磷殺蟲劑，其應用廣泛，因對害蟲有觸殺、胃毒等作用而被用于防治蚊蠅和臭蟲[1-3]。由于該藥物化學性質較為穩定，容易富集污染環境，并可通過食物鏈進入人體而危害健康。因此，早在2009年，我國就已全面禁止了滴滴涕的生產、使用和進出口。但時至今日，仍有部分養殖戶使用滴滴涕作為殺蟲劑，故對該農藥殘留進行檢測具有必要性[4-6]。

目前，檢測滴滴涕的方法大多為儀器方法[7-14]，但此類方法成本較高、檢測時間長、操作復雜，不符合基層實驗室高效、便捷的檢測要求。因此，本研究制備出一種滴滴涕的單克隆抗體，將其應用于膠體金免疫快速檢測試紙條，可實現高效、便捷的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等標準品（純度≥95%），購自北京標準物質研究中心；檸檬酸三鈉、碳酸鉀，購自北京百欣試劑公司；樣本提取劑、樣本復溶液、膠體金分析儀，由北京勤邦生物技術有限公司提供；渦旋儀、均質器，購自湖南湘立科學儀器有限公司[15-16]。

圖1 滴滴涕半抗原合成

1.2 方法

1.2.1 滴滴涕半抗原的制備

取1.7g鄰氯苯乙酸，加5mL氯苯，再加入1.8g水合氯醛，加熱至完全溶解后，加入三氯化鋁5.38g，室溫攪拌5h，停止反應，加水80mL和乙酸乙酯120mL，萃取分離，分去水相，有機相無水硫酸鈉干燥蒸干，得到黃色油狀物，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯（v/v，1/1）洗脫分離，得到乙酸滴滴涕半抗原產物1.8g，收率43.9%。

1.2.2 免疫原的制備—滴滴涕半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產物15mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC13.7mg和NHS10.9mg，充分混勻后，反應4h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白（BSA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液。將A液滴加到B液中，4℃反應24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-BSA偶聯物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

圖2 滴滴涕膠體金試紙條結果判定示意圖

1.2.3 免疫原的制備—滴滴涕半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產物9mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC7.6mg和NHS6.8mg，充分混勻后反應4h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白（OVA）50mg，加 0.05M PB溶解，得到 B液。將A液滴加到B液中，4℃反應24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-OVA偶聯物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.4 將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍干到微孔試劑上

將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物加入到微孔板中，冷凍干燥，得到滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍干的微孔試劑[15-16]。

1.2.5 檢測方法

向微孔中加入100μL待檢樣本溶液，混勻，室溫下培育3min。吸取70μL溶液滴至試紙條上，反應10min，根據示意圖判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果[15-16]。

1.2.6 樣本檢測限

在空白蔬菜、水果、飼料、牛奶樣本中分別添加滴滴涕標準品至質量濃度為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L，按照“1.2.5”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據實驗結果確定樣本檢測限[15-16]。

1.2.7 試紙條的特異性

分別配制500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，用膠體金免疫快速檢測試紙條進行檢測，重復測定3次，判斷試紙條的特異性[15-16]。

1.2.8 準確性

農業部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性[15-16]。取經過儀器確證的50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度小于5μg/kg）與50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度大于5μg/kg），用膠體金免疫快速檢測試紙條檢測滴滴涕的殘留量，計算假陽性率和假陰性率[15-16]。《農殘辦技術材料要求及審查程序》規定：試紙條假陽性率應小于5%，假陰性率應為零[15-16]。

表1 滴滴涕快速檢測試紙條的檢測限

表2 特異性測定

1.2.9 試紙條的穩定性

將試紙條保存于2～8℃環境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續測定15個月[15-16]。具體方法為：分別檢測經過儀器確證的20份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度小于5μg/kg）與20份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度大于5μg/kg），重復測定2次，根據實驗結果判定試紙條的穩定性[15-16]。

2 結果與分析

2.1 樣本檢測限

配置滴滴涕濃度分別為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，按照“1.2.5”步驟進行檢測，確定檢測限[15-16]。結果顯示，該試紙條的檢測限為5μg/kg，見表1。

2.2 特異性

用試紙條檢測500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，結果均呈陰性（見表2），表明該試紙條特異性較好[15-16]。

2.3 準確性

用試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率低于5%；用試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測結果均為陽性（見表3），說明該試紙條假陰性率為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求[15-16]。

表3 準確性測定

2.4 穩定性

試紙條保存12個月內，其假陽性率和假陰性率的檢測結果均符合要求；之后試紙條會出現少量失效、假陰性等現象[15-16]（見表4）。

3 討論

目前，有關檢測滴滴涕的文獻較為有限，本研究通過制備滴滴涕半抗原，讓其與載體蛋白偶聯得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，對試紙條進行了特異性、準確性、穩定性等性能測試，均符合要求。此外，該試紙條的檢測時間僅為15min，比現有文獻中儀器方法用時更短，操作更簡便。