大蒜素對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用

寧金卓，程帆，余偉民，李浩勇，饒婷，阮遠(yuǎn)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科,武漢 430000)

腎缺血再灌注損傷(IRI)經(jīng)常發(fā)生于失血性休克、腎移植、大血管手術(shù)等，可引起急性腎損傷，甚至急性腎衰竭[1]。雖然再灌注對于缺血性組織的存活是必不可少的，但有證據(jù)表明再灌注本身會引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞最終死亡[2]。大蒜素是大蒜主要的生物活性成分，研究表明大蒜素有抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗高血壓、抗炎、抗凋亡和降脂等藥理作用[3-5]。大蒜素還被報道具有抗氧化和保護腦缺血性損傷的作用[6]。本研究旨在研究大蒜素對腎臟IRI實驗?zāi)Ｐ捅Ｗo作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及器材 大蒜素,天津子涵生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，德國羅氏生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)檢測試劑盒，上海研卉生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,廣州威佳科技有限公司；Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C抗體，加拿大圣克魯斯公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組 40只健康雄性成年Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心,實驗獲武漢大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。動物飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物中心,允許自由飲食和飲水。大鼠經(jīng)腹腔注射2.0%苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，然后放置在恒溫設(shè)備上，保持直腸溫度為37～38 ℃。大鼠隨機分為以下4組,每組10只。(1)假手術(shù)組(A組)：暴露左側(cè)腎臟，僅游離左側(cè)腎蒂，不給予任何干預(yù)措施，暴露45 min 后縫合切口；(2)假手術(shù)+大蒜素組(B組)：A組基礎(chǔ)上腹腔注射50 mg/kg大蒜素進行干預(yù)；(3)腎臟IRI組(C組)：行腹部中線切口，用鈍性分離左側(cè)腎動脈和靜脈，用無創(chuàng)血管鉗夾閉左側(cè)腎蒂45 min，阻斷后可見被阻斷區(qū)腎葉顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色表明腎臟缺血成功，取下無創(chuàng)血管夾恢復(fù)腎臟血液供應(yīng)，縫合切口關(guān)腹；(4)腎臟IRI+大蒜素組(D組)：C組基礎(chǔ)上,于再灌注同時腹腔注射50 mg/kg大蒜素進行干預(yù)。

1.2.2 腎臟病理 腎臟組織標(biāo)本用0.9%氯化鈉注射溶液沖洗干凈后，置于4%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋,切片厚度4 μm，然后進行組織脫蠟、水化，用蘇木精和伊紅(HE)染色。

1.2.3 MDA和SOD測定 腎臟組織勻漿離心(3000 r/min,10 min)，收集上清液。用黃嘌呤氧化酶法測定SOD，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA，實驗重復(fù)3次。操作按照說明書進行。吸光度在532 nm處檢測MDA水平，單位為 nmol/g 蛋白。吸光度550 nm處測定SOD活性，單位為u/mg 蛋白。

1.2.4 腎小管上皮細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡檢測采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法，TUNEL陽性細(xì)胞顯示細(xì)胞核染成棕黃色。光鏡下(×200)每張切片選取10個視野，生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)(AI)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 免疫組織染色 Bax和caspase-3的表達采用免疫組織化學(xué)染色分析。石蠟切片脫蠟至水并浸泡于蒸餾水中，高溫高壓修復(fù)后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入TBS緩沖液中，沖洗3次，每次5 min。3%過氧化氫室溫20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，TBS沖洗3次，每次5 min。10%山羊血清孵育20 min，甩去血清，滴加一抗Bax，caspase-3后37 ℃孵育40 min。孵育完TBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加二抗，37 ℃孵育20 min，TBS沖洗3次，每次5 min。甩去TBS，采用Image-Pro Plus 6.0 進行免疫組織化學(xué)的圖片分析。

1.2.6 Western Blot檢測 剪碎腎臟組織勻漿裂解，4 °C下12 000 r/min離心5 min取上清。取20 μg樣品上樣電泳，隨后80 V電轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜上。室溫下，5%脫脂牛奶搖床上封閉1 h，分別加1∶100稀釋的抗Cyt-C 抗體(sc13156;Santa Cruz,CA)和1∶200稀釋的抗Bcl-2抗體 (sc7382;Santa Cruz,CA)，在4 °C過夜進行抗體孵育。TBST洗膜3次，每次5 min，標(biāo)記羊抗鼠二抗在室溫下孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，使用ECL試劑顯示蛋白條帶并拍照，使用Image J 成像分析軟件對結(jié)果進行半定量分析。

1.2.7 實時熒光定量(Real time-PCR)測定 采用Trizol法提取腎臟組織樣本總RNA，依操作說明取RNA 2 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 15 min，95 ℃ 40 s；循環(huán)條件為：95 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，40個循環(huán)(預(yù)變性，變性，退火，延伸)。引物序列：Bax正義鏈5′TGAACTGGACAACAACATGGAG3′,反義鏈5′AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC3′；Bcl-2正義鏈5′TTTGATTTCTCCTGGCTGTCT3′，反義鏈5′CTGATTTGACCATTT GCCTG3′；caspase-3正義鏈5′-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3′，反義鏈5′-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3′；Cyt-C正義鏈5′-TTGACGGACCCCAAAAGATG-3′，反義鏈5′-AGAAGGTGCTCATGTCCTCA-3′；GAPDH正義鏈5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，反義鏈5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。實驗測定所得Ct值即為mRNA表達水平，用2-△△Ct法得出各組樣品mRNA相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織的病理學(xué)改變 A組和B組未見明顯的組織病理學(xué)改變，可見腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無明顯變性、壞死；C組可見腎小管擴張和充血,腎小管上皮細(xì)胞腫脹和壞死，部分管腔狹窄；與C組相比，D組可見腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕，可見部分腫脹、變性,且管腔狹窄程度也較輕(圖1)。

2.2 腎臟組織中氧化應(yīng)激水平 結(jié)果顯示，與A組和B組相比，C組中MDA含量顯著升高而SOD活性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，與C組相比，D組中MDA含量明顯下降而SOD活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 Wistar大鼠腎臟組織中MDA

2.3 腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況 A組和B組中可見較少的、散在的腎小管上皮細(xì)胞凋亡；C組中凋亡細(xì)胞顯著增加，染色陽性細(xì)胞以遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞多見,與A組[AI：(4.24±0.85)%]和B組[AI：(4.28±0.82)%]相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組[AI：(12.25±1.27)%]細(xì)胞凋亡較C組[AI：(23.67±1.88)%]明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 腎臟組織中Bax和caspase-3免疫組織化學(xué) Bax,caspase-3在A組和B組中僅可見腎小管上皮細(xì)胞散在的陽性表達；C組中陽性表達明顯增多，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈現(xiàn)為黃色或棕黃色；D組中陽性表達較C組明顯減少(圖2)。

圖2 Wistar大鼠腎臟組織中Bax和caspase-3免疫組織化學(xué)結(jié)果(×200)：A為假手術(shù)組；B為假手術(shù)+大蒜素組；C為腎臟IRI組；D為腎臟IRI組+大蒜素組

2.5 腎臟組織中Bcl-2和Cyt-C蛋白表達 Western Blot法檢測腎臟組織中Bcl-2和Cyt-C蛋白水平。結(jié)果顯示，與A和B組比較，C組中Cyt-C蛋白表達水平增加，而Bcl-2蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，與C組相比，D組中Cyt-C蛋白含量顯著下降，Bcl-2蛋白表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 Wistar大鼠腎臟組織中Bcl-2和Cyt-C蛋白表達水平

2.6 腎臟組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表達 RT-PCR法檢測腎臟組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表達水平。結(jié)果可見，與A組和B組比較,C組中Bax、caspase-3和Cyt-C mRNA表達水平明顯增加，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與C組相比，D組中Bax、caspase-3和Cyt-C水平明顯下降，Bcl-2表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 Wistar大鼠腎臟組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyt-C mRNA的表達水平

3 討論

腎臟受到手術(shù)、創(chuàng)傷、休克或其他損傷時，常引起腎臟IRI。血液供應(yīng)重新建立，會導(dǎo)致活性氧的過度生成，可以改變細(xì)胞中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核糖核酸的性質(zhì)，造成細(xì)胞功能障礙甚至死亡[7]。而壞死的細(xì)胞引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)的激活，導(dǎo)致更嚴(yán)重的繼發(fā)性組織損傷[8]。針對腎臟IRI早期的治療具有重要意義。

大蒜素具有多種藥用功能，常用于治療多種疾病。Chen等[9]報道了大蒜素通過抑制氧化應(yīng)激保護H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凋亡；Kong等[6]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對缺血再灌注腦損傷的保護作用，可能與減少自由基和炎性因子的產(chǎn)生有關(guān)；研究認(rèn)為氧化應(yīng)激可通過缺血階段線粒體呼吸鏈的功能障礙而觸發(fā)，并在再灌注期被放大，導(dǎo)致直接損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)而引起細(xì)胞損傷[10]。正常情況下，代謝過程中產(chǎn)生的活性氧可以被內(nèi)源性抗氧化酶如SOD清除，過量的ROS生成和抗氧化能力的降低導(dǎo)致腎損傷加重[11]。MDA作為脂質(zhì)氧化的重要產(chǎn)物。降低MDA水平和SOD活性的降低對心臟IRI具有保護作用[12]。本研究表明，大蒜素可明顯使IRI腎臟組織中的MDA含量降低，SOD活性升高，從而減輕腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加抗氧化能力，減低腎臟組織學(xué)的損傷。

細(xì)胞凋亡在腎臟IRI的病理過程中有重要的作用[13]。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，能抑制脂質(zhì)過氧化物的形成及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放和自由基的產(chǎn)生[14]。Bax是Bcl-2的內(nèi)源性拮抗劑，促進細(xì)胞凋亡[15]。在生理狀態(tài)下，Bcl-2和Bax的表達保持平衡。缺血再灌注通過增加Bax蛋白表達水平和降低Bcl-2蛋白水平來激活細(xì)胞凋亡[16]。caspase的激活是細(xì)胞凋亡的另外一個顯著特征，其參與哺乳動物細(xì)胞凋亡細(xì)胞程序的啟動和執(zhí)行[17]。caspase-3由32 kDa酶原形成，通過凋亡配體和線粒體途徑裂解為活性17 kDa亞基，這是一種關(guān)鍵的效應(yīng)因子caspase，它在細(xì)胞凋亡的最后階段開始降解細(xì)胞[18]。過量的ROS同時激活線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，當(dāng)線粒體受損時，Bax的增加和Bcl-2的減少改變了線粒體外膜中Bax和Bcl-2的比例，促進細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放；Cyt-C激活凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3，最終誘導(dǎo)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡[19]。本研究表明，IRI組中,細(xì)胞凋亡明顯增高；經(jīng)大蒜素干預(yù)后，細(xì)胞凋亡較IRI組明顯降低；大蒜素在腎臟IRI中發(fā)揮了抗凋亡的作用。

總之，本研究證明大蒜素對大鼠腎臟IRI具有抗凋亡和抗氧化作用。但大蒜素對損傷的腎臟有保護作用的具體機制有待進一步闡明。