冬凌草對高糖-高脂誘導的非酒精性脂肪性肝病大鼠模型線粒體功能及氧化應激的影響

成伯寧，劉殿雷，史婷婷，田芳，金劍虹

(1.浙江杭州市中醫院，a內分泌科，b外科，杭州 310007；2.浙江杭州市西溪醫院肝病科)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全球常見的慢性肝病之一[1]。Tateishi等[2]研究表明：NAFLD主要包括：單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關肝硬化和肝細胞癌。NASH 是繼慢性病毒性肝炎和酒精性肝炎后，肝纖維化的又一大成因。數據顯示： NASH患者在3至4 年內發生肝纖維化[3]。肝纖維化(LF)是對各種肝損傷的創傷愈合反應，其病理過程特征主要是以細胞外基質生成和降解失衡，造成大量細胞外基質在肝內沉積造成的[4]。目前治療NAFLD的藥物不多，大多數藥物具有一定的副作用，冬凌草是一種中藥，研究表明冬凌草具有清熱解毒、抗腫瘤、保肝降酶的作用[5]。但目前關于冬凌草對NAFLD的作用機制尚不完全統一。本文旨在探究冬凌草對高糖-高脂誘導的NAFLD大鼠模型線粒體功能及氧化應激的影響，為NAFLD的治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級3周齡SD大鼠60只，購自廣東醫學院實驗動物中心(粵監證字 2018A029號)，飼養溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，該實驗經過杭州市中醫院動物倫理委員會批準同意，本實驗嚴格遵循動物實驗3-R原則。

1.2 藥物與試劑 大鼠飼料購自西南醫科大學實驗動物中心；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒均購自上海恒遠生物科技有限公司；中性甲醛、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(貨號：C2006)購自碧云天有限公司。

1.3 儀器 Sysmex-chemix-180 型全自動生化分析儀購自日本 Furuno Electric公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統有限公司；TGL-16M低溫離心機購自濟南來寶醫療器械有限公司；3-5w低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學儀器廠；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司；UV-1800雙光束紫外可見分光光度購自上海美析儀器有限公司。

1.4 分組及建立模型方法 將60只大鼠適應性喂養1周，隨機選15只為對照組，其余45只大鼠采用高脂飼料喂養制成非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，制作方法及判斷模型是否成功參考宓偉等[6]研究。具體操作如下：空白組予以普通飼料喂養，實驗組(模型組、低劑量冬凌草組、高劑量冬凌草組)予以等重量高脂飼料喂養，兩組均自由飲水。其中高糖-高脂飼料在普通飼料的基礎上加16%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、2%豬膽鹽，3周后禁食12 h后，眼球取血，分離血清，全自動生化分析儀測定膽固醇、三酰甘油水平，大鼠處死后迅速開腹，觀察肝臟形態，實驗組大鼠肝細胞明顯腫脹，肝組織內可見彌漫分布的大脂滴及微脂滴，并散布全肝，則認為非酒精性脂肪性肝病大鼠建模成功，空白組大鼠均存活，存活率100%，造模的45只大鼠死亡6只，存活率86.7%，剩余39只平均分到各組，每組13只。

1.5 藥物干預 參考宋琪雯等[7]使用的冬凌草劑量，本研究低劑量冬凌草組和高劑量冬凌草組使用分別使用4 g·kg-1·d-1和8 g·kg-1·d-1的冬凌草灌胃治療3周，對照組和模型組采用等劑量的0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，所有大鼠均處理3周。

1.6 檢測項目

1.6.1 大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、r-谷氨酸轉移酶(GGT)測定 處死大鼠并眼球取血0.1 mL，分離血清，各按照全自動生化檢測儀使用方法檢測大鼠血清LT、AST、GGT含量變化。

1.6.2 大鼠線粒體功能檢測 剪碎大鼠肝臟組織置于勻漿器內勻漿，研磨后轉移到離心管內，在4 ℃恒溫下，以3 700 r/min，離心5 min，取沉淀使用超聲破碎儀破碎線粒體并加入倒入1.5 mL裂解液，配制雙縮脲試劑、制作標準曲線及測定線粒體含量均按試劑盒要求進行。

取上述大鼠肝臟制成的線粒體懸浮液，應用紫外光光度法測定細胞色素氧化酶活性，用分光光度計在350 nm處測定其吸光度。根據標準液求得的回歸方程，計算出被過氧化氫氧化生成的碘量，根據空白與測試樣品兩者之差，計算出過氧化氫酶的活性。

取上述大鼠肝臟制成的線粒體懸浮液，采用試劑盒測線粒體膜電位具體操作方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6.3 大鼠血清氧化應激物質含量檢測 剪碎大鼠肝臟組織置于勻漿器內勻漿，研磨后轉移到離心管內，在4 ℃恒溫下，以3 700 r/min，離心5 min，取沉淀使用超聲破碎儀破碎線粒體并加入倒入1.5 mL裂解液，使用MDA、SOD、LDH試劑盒子，嚴格按照試劑盒操作進行檢查其水平。

2 結果

2.1 大鼠肝功能檢測結果 檢測大鼠肝功能指標看出，相比空白組，模型組大鼠ALT、AST、GGT水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠ALT、AST、GGT水平顯著降低，且高劑量冬凌草組大鼠ALT、AST、GGT顯著低于低劑量冬凌草組(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠肝功能檢測結果

2.2 大鼠線粒體功能檢測結果 檢測大鼠肝臟線粒體相關指標發現，相比空白組，模型組大鼠線粒體含量、細胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著降低(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠線粒體含量、細胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著升高，且高劑量冬凌草組大鼠線粒體含量、細胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著高于低劑量冬凌草組(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠線粒體功能檢測結果

2.3 大鼠血清氧化應激檢測結果 檢測大鼠血清內氧化應激物質含量結果顯示，相比空白組，模型組大鼠MDA、LDH含量水平顯著升高，SOD含量水平顯著降低(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠MDA、LDH含量水平顯著降低，且高劑量冬凌草組大鼠MDA、LDH含量水平顯著低于低劑量組(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠SOD含量水平顯著升高，且高劑量冬凌草組大鼠SOD含量水平顯著高于低劑量組(P<0.05)，見表3。

表3 大鼠血清氧化應激檢測結果

3 討論

血清ALT、AST活力的大小是檢驗肝臟損傷的重要指標之一[8]。當肝細胞發生酒精性損傷后，細胞破裂，胞漿中的 ALT 和 AST 會釋放進入血液循環，造成血清中轉氨酶含量升高。血清ALT、AST及GGT活力的大小直接反映了肝細胞受損的程度[9]。本研究發現，相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠體質量顯著降低且ALT、AST、GGT水平顯著降低。說明冬凌草可以有效緩解非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟受損程度，這可能是因為冬凌草的主要化學成分是貝殼杉烯類二萜，具有降低炎性反應的效果，同時可以保護肝臟細胞，防止細胞破損而造成ALT和AST進入血液循環。姚會枝[10]研究表明：冬凌草的主要成分烯類二萜可以有效降低血清中ALT和AST含量水平。本研究得出的結論與其一致。

線粒體是全身能量代謝的中心，一旦肝臟中的線粒體功能出現了異常，對肝臟的功能影響較大[11-12]。細胞色素C氧化酶是線粒體氧化能力的關鍵調節部位，在能量產生中起主要作用。本研究發現，使用冬凌草處理各組大鼠肝臟線粒體含量、細胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著升高。說明冬凌草可以有效保護線粒體，通過保護線粒體維持肝臟正常功能。姬愛冬等[13]研究表明：提高大鼠肝臟線粒體含量、細胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差可以有效緩解非酒精性脂肪肝的損傷。本研究得出的結論與其一致。

MDA會引發脂質過氧化反應，細胞內氧化程度越高，MDA含量水平越高，SOD具有抗氧化性，是經典的抗氧化酶之一，可以有效清除活性氧。機體內SOD水平越高說明機體清除活性氧的能力越強，當腦組織損傷時，其含量會顯著降低[14]。本研究發現，相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠SOD含量水平顯著升高。說明冬凌草可以緩解氧化應激反應，這可能是因為冬凌草的主要活性成分是冬凌草甲素，具有抗氧化性。吳嵐等[15]研究表明：冬凌草可以通過抑制氧化應激反應治療非酒精性脂肪肝。本研究得出的結論與其相一致。

綜上所述，冬凌草通過保護線粒體功能并抑制氧化應激反應治療非酒精性脂肪性肝病，在一定濃度范圍內呈劑量依賴性，但本實驗涉及到的樣本量較少，在后續的實驗中將進一步擴大樣本量進行研究。