正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化郁金香總生物堿提取工藝

葛碧琛 陳小舉 蔣慧慧

摘 要：采用醇提取法優(yōu)化郁金香中總生物堿提取工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溶劑、液固比（液體體積與固體質(zhì)量的比值）、提取時(shí)間為影響因素，郁金香總生物堿提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，郁金香總生物堿的最佳提取工藝條件為：提取溶劑為70%乙醇溶液，液固比為40，提取時(shí)間為6h，此工藝條件下總生物堿提取率為（1.869±0.03）%。該方法簡單快速，穩(wěn)定高效，可用于醇提郁金香總生物堿實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：郁金香;總生物堿;正交實(shí)驗(yàn);提取工藝

中圖分類號(hào)：O69;R284.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2020）09-0031-05

1 前言

郁金香（Tulipa gesneriana L.）是百合科郁金香屬的多年生草本植物，具球莖。由于其花卉剛勁挺拔，葉色素雅秀麗，被譽(yù)為花中皇后，是伊朗、荷蘭、匈牙利等國的國花[1]。經(jīng)過園藝家們長期的雜交栽培，全世界已擁有八千多個(gè)品種，其中大約有150種較為常見。如今郁金香已在世界各個(gè)角落普遍種植，中國各地庭園中也多有栽培。由于郁金香觀賞價(jià)值高，且價(jià)格昂貴，國內(nèi)外學(xué)者主要對郁金香的栽培、生長發(fā)育等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，如左巖[2]闡述了溫室郁金香優(yōu)化栽培技術(shù);王吉福[3]主要針對高寒地區(qū)郁金香露地栽培技術(shù)進(jìn)行了研究;Sun Yuan[4]等主要考察了立體栽培對郁金香光合特性和生長的影響;Derbyshire[5]研究了在南非的水培系統(tǒng)中郁金香栽培的營養(yǎng)需求。

目前鮮有人對郁金香的藥用價(jià)值進(jìn)行深入研究。在古代的草藥書籍中，對于郁金香藥用價(jià)值只在很少的參考文獻(xiàn)中描述。《本草拾遺》中有如下記載：主一切臭，除心腹間惡氣鬼疰，入諸香藥用之[6]。《新疆藥用植物志·第二冊》（1979版）記載伊犁郁金香的鱗莖有清熱、解毒、散結(jié)和化瘀功效，可治咽喉腫痛等癥狀[7]。國內(nèi)學(xué)者對郁金香的藥用價(jià)值研究也十分有限。許國英等[8]對新疆采集到的7種郁金香進(jìn)行成分分析，研究結(jié)果表明其中6種郁金香都含有秋水仙堿以及其他種類的生物堿。夏提古麗·阿不利孜[9]采用系統(tǒng)預(yù)試法對郁金香可能所含的化學(xué)成分進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明郁金香中含有多種天然活性成分，且地上與地下部分所含成分有所不同。毛科科[10]等選用荷蘭狂詩人郁金香為原料，采用HD法水上蒸餾提取純露，研究結(jié)果表明純露中含有糖類、氨基酸類和黃酮類化合物。

由此可見，郁金香同時(shí)具備較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以郁金香為研究對象，選取郁金香地上部分進(jìn)行生物堿定性鑒別，并首次以總生物堿含量為指標(biāo)，采用單因素分析，對提取溶劑濃度、液固比、提取時(shí)間這三個(gè)因素對郁金香總生物堿提取率的影響進(jìn)行考察，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取方案，得到最佳的提取工藝參數(shù)。為更全面、實(shí)用、深入地研究、開發(fā)和利用郁金香資源提供了理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

新鮮郁金香，2018年4月采購自安徽省合肥市（郁金香產(chǎn)地為云南昆明）;秋水仙堿對照品，中國食品藥品檢定研究院批號(hào)：101176-201202;乙醇、石油醚、硅鎢酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);碘化鉍鉀試劑、碘化汞鉀試劑，實(shí)驗(yàn)室自制。

XY1000-ZL型電子天平（常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）;DHG-9070AE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（州普天儀器制造有限公司）;HH-W600型數(shù)顯三用恒溫水箱（榮華儀器制造有限公司）;SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海鵬奕儀器有限公司）;DF-101S型集熱式加熱攪拌器（常州普天儀器制造有限公司）;JK-500DB型數(shù)控超聲清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）;TDZ5-WS型離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司）;UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 郁金香預(yù)處理及生物堿的提取與鑒定

將郁金香洗凈，對其莖、葉、花瓣、花蕊分別進(jìn)行60℃干燥處理。然后將干燥后的郁金香研磨，過4號(hào)篩，得郁金香不同部位粉末。

分別稱取郁金香不同部位粉末1.5g于燒瓶中，加入80%乙醇30mL，60℃水浴回流3h，連續(xù)三次過濾提取液，10mL石油醚脫色兩次，得提取液。

取不同部位的提取液于試管中，分別滴入硅鎢酸、碘化汞鉀和碘化鉍鉀試液，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，鑒別郁金香不同部位是否含有生物堿。

2.2.2 對照品及供試品溶液的配制

對照品溶液的配制：精密稱取秋水仙堿對照品100mg，用乙醇定容于100mL容量瓶中，得濃度為1mg/mL的對照品母液。

供試品溶液的配制：精密稱取郁金香粉末（過4號(hào)篩）1.5g于燒瓶中，加入80%乙醇30mL，60℃水浴回流3h，連續(xù)三次過濾提取液，10mL石油醚脫色兩次，得到的提取液濃縮干燥并稱重。

取濃縮提取物0.1g，10mL乙醇復(fù)溶，超聲波溶解10min，高速離心機(jī)離心10min，取上清液1mL于10mL容量瓶中定容至刻度，再從中取1mL于5mL容量瓶中定容至刻度，得濃度為0.2mg/mL供試品溶液，可進(jìn)行生物堿定性鑒別試驗(yàn)。

2.2.3 最大吸收波長的確定

精密吸取各相同體積的對照品溶液、供試品溶液，加入無水乙醇，混勻，設(shè)置掃描波段為200nm～500nm，掃描波長間隔為1nm，置于紫外分光度儀中進(jìn)行全波長掃描，確定秋水仙堿的最大吸收波長。

經(jīng)過波長掃描結(jié)果顯示生物堿在243nm和352nm處均有明顯的吸收峰，其中243nm處為最大吸收峰，由此可確定總生物堿的吸收波長為243nm。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.25mL對照品溶液，分別定溶于10mL容量瓶中。以秋水仙堿對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立線性回歸，得到回歸方程y=73.472x+0.002，R=0.9999。結(jié)果表明秋水仙堿在5-12.5μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 郁金香總生物堿的提取與測定

稱取一定量的郁金香粉末，在不同的提取溶劑、料液比、時(shí)間下進(jìn)行提取，連續(xù)三次過濾提取液，石油醚脫色兩次，得到的提取液濃縮干燥并稱重。取0.1g濃縮提取物，接下來的操作同2.2.2中供試品的配制方法，每個(gè)試樣平行測量三次，取吸光度平均值，根據(jù)回歸方程，按照以下公式計(jì)算郁金香總生物堿提取率：

y/%=×100

式中：y為生物堿得率，單位%;ρ為提取液中生物堿的質(zhì)量濃度，單位μg/mL;V為提取液總體積，單位mL;m1為總提取濃縮物質(zhì)量，單位mg;m2為測量時(shí)稱取的提取濃縮物質(zhì)量，單位mg;m3為郁金香粉末質(zhì)量，單位mg;103為μg換算成mg。

2.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

以郁金香中總生物堿提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察提取溶劑濃度（50%、60%、70%、80%、90%，固定液固比為20，60℃水浴回流3h）、液固比（10、20、30、40、50，固定提取濃度為80%乙醇，60℃水浴回流3h）、提取時(shí)間（1.5、3、4.5、6、7.5h，固定提取溶劑為80%乙醇，液固比為20，60℃水浴回流）3個(gè)因素對郁金香總生物堿提取率的影響。每個(gè)單因素進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

2.2.7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溶劑（A）、液固比（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，以總生物堿提取率為考察指標(biāo)，采用L9（33）正交表，通過SPSS設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選最佳提取工藝條件，因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

2.2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，準(zhǔn)確稱取郁金香粉末3份，每份1.5g，在上述確定的最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，計(jì)算總生物堿提取率。

3 結(jié)果與分析

3.1 郁金香生物堿的提取與鑒定結(jié)果

取郁金香地上部位花、莖、葉、花蕊的提取液于試管中，分別滴入硅鎢酸、碘化汞鉀和碘化鉍鉀試液，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，鑒別郁金香不同部位是否含有生物堿。結(jié)果如表2所示。由表2中可以看出，郁金香的不同部位中，莖、葉、花中均含有生物堿，而花蕊中未檢測到生物堿成分。因此，為方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行可將三個(gè)花、莖、葉三個(gè)部位混合制成郁金香粉末，不影響總生物堿含量的測定。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 提取溶劑對總生物堿提取率的影響

隨著乙醇濃度的增加總生物堿提取率增加。如圖1所示，提取溶液濃度為80%時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)增加乙醇濃度，總生物堿提取率反而降低，因此選擇乙醇濃度70%、80%、90%作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的三水平。

3.2.2 液固比對總生物堿提取率的影響

隨著提取溶劑用量的增加，總生物堿提取率隨之增加，如圖2所示，當(dāng)液固比為20-40范圍內(nèi)，增大提取溶劑用量對總生物堿提取率影響不明顯，呈現(xiàn)緩慢的增長，繼續(xù)增加提取溶劑用量總生物堿提取率反而下降，因此選擇液固比20、30、40作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的三水平。

3.2.3 提取時(shí)間對總生物堿提取率的影響

隨著提取時(shí)間的增加，總生物堿提取率也隨之增加，如圖3所示，提取時(shí)間為4.5h時(shí)總生物堿提取率達(dá)到最高，隨著提取時(shí)間的延長，總生物堿提取率逐漸下降，因此選擇提取時(shí)間3.0、4.5、6h作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的三水平。

3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表3、4所示。由表3中的R值可知，在所考察的三種因素中，對總生物堿提取率影響大小的順序?yàn)椋海˙）>（C）>（A），即液固比的影響最大，其次是提取時(shí)間、提取溶劑，其中液固比對總生物堿提取率有顯著影響。通過k值可判斷出最佳的提取條件是：A1B3C3，即采用70%乙醇溶液，液固比為40，提取6h。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取郁金香粉末3份，每份1.5g按優(yōu)選出來的最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，即采用70%乙醇溶液，液固比為40，提取6h。由驗(yàn)證結(jié)果可知，按最佳工藝條件總生物堿提取率為（1.869±0.03）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.60%，結(jié)果與理論最佳工藝總生物堿提取率相近且高于正交實(shí)驗(yàn)其他組合，說明工藝條件穩(wěn)定可行，結(jié)果見表5。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以郁金香為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定提取溶劑、液固比、提取時(shí)間對總生物堿提取率的影響，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化分析得到郁金香總生物堿的最佳提取工藝：提取溶劑為70%乙醇溶液，液固比為40，提取時(shí)間為6h。經(jīng)過驗(yàn)證，此條件下總生物堿提取率為（1.869±0.03）%，與理論最佳工藝總生物堿提取率接近，說明該優(yōu)化工藝有可行性。

本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對郁金香不同部位中的各種天然活性物進(jìn)行提取并鑒別，研究結(jié)果顯示，郁金香中含有黃酮化合物、生物堿、萜類化合物、甾體化合物、蛋白質(zhì)和糖類等天然活性成分，且郁金香各部位所含的天然活性成分種類無明顯差別，但其含量有所差別，尤其是生物堿成分在沉淀反應(yīng)中現(xiàn)象顯著。生物堿是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機(jī)化合物，有似堿的性質(zhì)。生物堿大多數(shù)有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮素多存在于在環(huán)內(nèi)，有顯著的生物活性，是中草藥中一種重要的有效成分。按照生物堿的基本結(jié)構(gòu)，可大致分成60類。其中大多數(shù)有藥用價(jià)值，如附子中的烏頭堿具有強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)痛的功效[11-13];麻黃堿、偽麻黃堿等生物堿具有緩解支氣管平滑肌痙攣的作用[14];長春新堿具有抗癌作用[15]。當(dāng)前鮮有關(guān)于郁金香中生物堿的相關(guān)研究，本課題為郁金香藥用價(jià)值的進(jìn)一步研究、開發(fā)以及郁金香中總生物堿提取工藝的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

目前，生物堿的提取工藝主要有溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法以及其他方法[16-18]。本研究采用實(shí)驗(yàn)室最常用的醇提取法。該法根據(jù)相似相容原理能夠盡可能多地將郁金香中的生物堿成分溶出。但研究仍有一些不足之處，如未考慮到提取溫度對總生物堿的影響，提取時(shí)間長，提取物中雜質(zhì)多，提取率不太高等。故今后應(yīng)拓寬研究思路，嘗試其他提取工藝技術(shù)或多種工藝協(xié)同提取，不斷創(chuàng)新郁金香總生物堿提取工藝技術(shù)，努力提高總生物堿提取率。同時(shí)，應(yīng)開展郁金香生物堿生物活性研究，如體外抗氧化活性、抑菌活性等，為郁金香中生物堿的合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和有力的技術(shù)支持，使郁金香生物堿的藥用價(jià)值在促進(jìn)人類健康中發(fā)揮積極作用。

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