3個山羊群體NPY-Y1R基因的多態性與繁殖性能

李平 龍清孟 張蕓 陳大芳 譚曉山 周迪 李瀟蒙 李俊 馮文武

摘要：以貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞3個品種為試驗群體，采用PCR產物直接測序技術檢測NPY-Y1R基因的多態性，并探討其多態性對山羊繁殖性狀的影響，為山羊繁殖力的標記輔助選擇和育種提供理論依據。利用Excel計算基因頻率、基因型頻率;利用POPGEN軟件計算遺傳多態性參數純合度、雜合度、有效等位基因數和多態信息含量并對Hardy-wein-berg平衡狀態進行分析;用SPSS軟件對3個山羊群體NPY-Y1R基因多態性與產仔數進行相關性分析。結果表明，NPY-Y1R基因外顯子中檢測到1個單核苷酸多態性（SNP）位點，NPY-Y1R基因在外顯子2處存在突變位點G1141A，3個山羊群體在此突變位點處均存在2種基因型，分別為AG、GG;貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞χ2均未達到顯著水平，處于Hardy-Wein-berg平衡狀態，貴州黑山羊和努比亞表現為低度多態，酉州烏羊表現為中度多態。AG基因型個體在貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞群體中產羔數顯著高于GG基因型個體（P<0.05），呈現出AG>GG趨勢。AG基因型個體的山羊在后續的試驗中待進一步認證，結果可為初步判定山羊NPY-Y1R基因的突變與繁殖性能的研究奠定試驗基礎。

關鍵詞：貴州黑山羊;酉州烏羊;努比亞山羊;NPY-Y1R基因多態性;繁殖性能

中圖分類號：S827.3 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0171-03

神經肽Y1受體（NPY-Y1R）是含有36個氨基酸殘基的一種單鏈多肽，廣泛分布于中樞神經系統和外周神經系統，與YY肽和胰多肽一起構成多肽家族[1-2]?？蒲腥藛T在小鼠上研究發現，NPY-Y1R基因敲除能夠損害小鼠促性腺軸，使小鼠對能量貯存感知的能力下降[3-4]，同時發現NPY-Y1R基因在下丘腦中的表達受身體能量平衡變化的影響[5]，NPY-Y1R基因在生殖功能調節與性發育中有重要作用，可能是影響山羊產羔數性狀的一個主效基因[6]。儲明星等在山東濟寧青山羊上研究發現NPY-Y1R基因的EF型濟寧青山羊產羔數比EE型多0.58只（P<0.01），并且F等位基因與濟寧青山羊性早熟和高繁殖力相關[1]。樊奇在貴州白山羊和川東白山羊2個群體中發現，AB基因型山羊產羔數顯著高于AA基因型（P<0.05），而在古藺馬羊、貴州白山羊和川東白山羊3個群體中AA型和AB型之間的初生質量最小二乘均值沒有顯著差異（P>0.05）[2]。目前，NPY-Y1R基因在山羊上的研究并不是很多，本研究以貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞3個山羊群體為研究對象，利用分子遺傳標記輔助選擇手段，研究NPY-Y1R基因在3個山羊群體中的多態性及對繁殖性狀的影響，旨在為選育山羊高產仔率品種和培育高繁殖性狀羊群提供理論依據，并應用于在實踐生產中。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采集自貴州省黔西南布依族苗族自治州冊亨縣冗渡鎮貴州領頭羊山地草牧業科技有限公司。采取前腔頸靜脈采血方式，采集93只經產貴州黑山羊、72只酉州烏羊、63只努比亞的血液，于-20 ℃保存血液備用。整理收集3個品種山羊產仔記錄數據。

1.2 血液DNA提取

血液樣本DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產的血液基因組DNA提取試劑盒，用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質量進行檢測。通過超微量紫外分光光度計NanoDrop-ONE檢測DNA D260 nm/D280 nm比值。

1.3 引物設計與合成

引物參照儲明星等的引物設計方法[1]，合成NPY-Y1R基因2個外顯子的引物序列見表1。引物由上海立菲生物技術有限公司合成。

1.4 PCR擴增

以貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為20 μL，其中PCR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，加蒸餾水至反應體系為20 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，退火（退火溫度見表1）30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。

1.5 PCR產物測序

用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，凝膠成像系統觀察電泳結果。選擇條帶單一、清晰明亮、產量高的PCR產物送上海立菲生物技術有限公司進行雙向測序。用DNAStar軟件中的SeqMan對序列結果進行分析。

1.6 遺傳多態性分析

應用數據統計軟件計算NPY-Y1R基因的基因頻率、基因型頻率。利用POPGEN軟件計算遺傳多態性參數純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）和多態信息含量（PIC），并對Hardy-Wein-berg平衡狀態進行分析。

1.7 NPY-Y1R基因與產仔數關聯性分析

利用SPSS軟件對3個品種山羊群體NPY-Y1R基因多態性與產仔數進行關聯性分析，結果以（平均值±標準誤）表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 DNA檢測結果

提取的貴州黑山羊、酉州烏羊和努比亞血液基因組DNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰明亮，無RNA和蛋白質等污染（圖1）。利用超微量紫外分光光度計Nano Drop-ONE檢測DNA，D260nm/D280 nm值在1.8～2.0之間，說明DNA提取效果好，純度高。結合圖像及檢測結果判斷提取的DNA純度與質量可滿足后續試驗要求。

2.2 PCR產物檢測結果

NPY-Y1R基因PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在187、219 bp處有清晰條帶，與預期片段大小一致。

2.3 測序結果分析

經測序發現3個山羊群體在NPY-Y1R基因的第2外顯子2上的G1141A位點處有突變，并且3個山羊群體均存在2種基因型，分別為AG、GG型，存在多態性見圖2。3個山羊群體在NPY-Y1R基因第2外顯子1上，均未發現多態性。

2.4 NPY-Y1R基因的基因型頻率和等位基因頻率

3個品種山羊群體NPY-Y1R基因在G1141A位點上，不同基因型的基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳多態性見表2。3個群體NPY-Y1R基因的G1141A位點G等位基因頻率高于A等位基因頻率，G為優勢等位基因;GG基因型頻率高于AG，GG為優勢基因型。3個品種山羊群體χ2均未達到顯著水平， 處于Hardy-Weinberg平衡狀態。3個品種的基因純合度均較高。根據多態信息含量的標準：PIC≥0.50為高度多態，0.50>PIC≥0.25為中度多態，PIC<0.25為低度多態，貴州黑山羊和努比亞表現為低度多態，酉州烏羊表現為中度多態。

2.5 NPY-Y1R基因不同基因型對不同品種羊產羔數的影響

利用SPSS軟件對3個山羊群體NPY-Y1R基因多態性與產羔數進行相關性分析。從表3可以看出，貴州黑山羊NPY-Y1R基因AG、GG這2種基因型群體的的平均產羔數分別為1.75、1.15只，AG型產羔數比GG型多0.60只，2個基因型之間產羔數差異顯著;酉州烏羊NPY-Y1R基因AG、GG這2種基因型群體平均產羔數分別為1.63、1.15只，AG型產羔數比GG型多0.48只，2個基因型之間產羔數差異顯著;盧比亞NPY-Y1R基因AG、GG 2種基因型群體平均產羔數分別為1.50、1.17只，AG型產羔數比GG型多0.33只，2個基因型之間產羔數差異顯著。

3 結論與討論

近些年，研究人員不斷地挖掘NPY-Y1R基因的突變位點，并且有研究發現NPY-Y1R基因可能是影響山羊產羔數性狀的一個主效基因。國內外對NPY-Y1R基因在山羊上的研究較少。儲明星等在濟寧青山羊、波爾山羊、安哥拉山羊和內蒙古絨山羊上對NPY-Y1R基因進行多態性研究發現，在G1141A位點處4個山羊品種中都存在突變，為CC型與CD型2種基因型，CC和CD基因型濟寧青山羊上的產羔數差異不顯著;在C1330T位點處濟寧青山羊上存在突變，為EE型、EF型2種基因型，EF型濟寧青山羊產羔數均值比EE型多0.58只，表明NPY-Y1R基因的F等位基因可能與濟寧青山羊性早熟和高繁力相關[1]。

本試驗在3個山羊群體NPY-Y1R基因外顯子中檢測到1個單核苷酸多態性（SNP）位點，NPY-Y1R基因在外顯子2處存在突變位點G1141A，在此突變位點處3個山羊群體均存在2種基因型，分別為AG、GG。產羔數關聯分析顯示，G1141A位點與貴州黑山羊、努比亞試驗群體繁殖性狀顯著相關，具體表現為貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞AG基因型個體的產羔數均高于GG基因型個體，本試驗推斷AG基因型可能是貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞繁殖性能的優勢基因型，NPY-Y1R基因的G1141A位點可望作為貴州黑山羊、酉州烏羊、努比亞等繁殖性能選擇的遺傳標記而應用于山羊的分子選育。

參考文獻：

[1]儲明星，馮 濤，趙有璋，等. 神經肽Y-Y1受體基因（NPY-Y1R）多態性及其與山羊繁殖性能關系[J]. 農業生物技術學報，2009，17（6）：960-966.

[2]樊 奇. 中國西南地區山羊繁殖性能相關候選基因的研究[D]. 重慶：重慶大學，2012.

[3]Gonzales C，Voirol M J，Giacomini M，et al. The neuropeptide Y Y1 receptor mediates NPY‐induced inhibition of the gonadotrope axis under poor metabolic conditions[J]. The FASEB Journal，2004，18（1）：137-139.

[4]Gamba M，Pralong F P. Control of GnRH neuronal activity by metabolic factors：the role of leptin and insulin[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2006，254：133-139.

[5]Eva C，Serra M，Mele P，et al. Physiology and gene regulation of the brain NPY Y1 receptor[J]. Frontiers in Neuroendocrinology，2006，27（3）：308-339. 9.

[6]Pellieux C，Sauthier T，Domenighetti A，et al. Neuropeptide Y （NPY） potentiates phenylephrine-induced mitogen-activated protein kinase activation in primary cardiomyocytes via NPY Y5 receptors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（4）：1595-1600.