高效解鉀菌的分離篩選鑒定及其對山區黃瓜的促生效果

宋聰 宋水山 賈振華

摘要：我國耕地土壤鉀元素嚴重匱乏，亟須解決我國北方山區土壤缺鉀的現狀，尋求鉀肥替代技術。從各地土壤中篩選得到1株高效解鉀菌32-2，在含鉀礦石的復篩培養基中發酵15 d，發酵液中可溶性鉀含量達到37.77 mg/L，是對照的16.22倍，經鑒定為草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。通過盆栽試驗結果表明，與對照相比，32-2對黃瓜種子、幼苗有顯著的促生效果，其中發芽率提高13.33百分點，發芽勢提高8.08百分點，株高、地下鮮質量、地上干質量、壯苗指數、干重根冠比、根系活力分別提高15.83%、13.95%、7.45%、5.19%、9.46%、38.52%;同時，可顯著提高黃瓜產量和品質，黃瓜產量增加8.50%，可溶性固形物、可溶性糖、維生素C、可溶性蛋白含量分別提高6.82%、2.78%、43.21%、20.90%。今后32-2可用于微生物肥料的開發。

關鍵詞：土壤解鉀菌;篩選;鑒定;草木樨中華根瘤菌;黃瓜;促生效果

中圖分類號： S182;S642.206 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0266-04

鉀是植物生長所必需的三大營養元素之一，直接影響著植物的生長發育和抗逆性[1]。我國北方山區農作物生長緩慢，品質和產量均低于平原地區，這跟土壤有機質含量低、微生物數量與種類少、植物生長的營養元素缺乏等有關，其中有效鉀含量低是造成植物生長緩慢的主要因素之一。實際上北方山區土壤并不缺鉀，然而95%的土壤鉀以礦物鉀的形態存在，主要存在于鉀長石和云母中[2]，不能直接被農作物吸收和利用。因此，如何轉化土壤中的礦物鉀為有效鉀，對緩解我國鉀素供給的壓力、提高農作物產量具有重要意義。微生物是地球礦質元素轉化的原動力，采用解鉀微生物作為土壤中鉀素資源利用的轉化因子，是解決山區土壤缺少有效鉀的有效途徑。

吳洪生等研究表明，在一定條件下，鉀細菌制劑可分解土壤礦物中難溶性鉀，使土壤速效鉀含量比對照提高128.6%[3]。張紅娟等試驗結果表明，接種鉀細菌能促進土壤中速效鉀、磷含量較對照分別提高13.2%、84.5%[4]。多項研究結果表明，解鉀菌對多種植物具有促進生長、改善品質的作用。其中，郭勛斌等發現解鉀菌對水稻的生長發育具有促進作用[5]。吳洪生等研究指出，解鉀菌還可改善花生品質，使花生增產17.93%[6]。薛智勇等研究發現，甘薯接種解鉀菌可增產6.95%～10.27%[7]。那文志等田間試驗結果表明，解鉀菌對大豆有明顯的增產效果，較對照增產16.85%，還可提高大豆根瘤的結瘤數，并在一定程度上抑制病蟲害，起到防病、抗病、增產的效果[8]。雖然關于高解鉀率的細菌已有報道，但其絕對解鉀量還是很小的，所以分離篩選高效解鉀菌株仍是現在研究的重點之一。本試驗從全國不同山區采集的土樣中分離篩選高效解鉀菌株并進行鑒定，檢測篩選到的解鉀菌株對鉀元素的利用效果，同時研究解鉀菌對黃瓜種子、幼苗的促生效果及產量和品質的影響，為微生物肥料的開發提供理論依據和材料基礎。

據資料顯示，我國的鉀肥生產只占世界的0.34%，而消耗量卻占14.7%，雖然每年進口約600萬t鉀肥[9]，但仍不能滿足農業生產對鉀肥的需要。在化學鉀肥供不應求的情況下，開辟新的效果好、成本低、無污染的微生物肥料，挖掘山區土壤中的鉀素資源，具有重要的研究和應用意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤和菌株 試驗用于解鉀菌分離的土壤分別采集于河北、黑龍江、山西、云南等地的山區和丘陵地區，土壤樣品共75個;供試菌株主要為膠質狀芽孢桿菌10013，購自中國農業科學院微生物菌種保藏管理中心;黃瓜品種為津研1號，由天津農業科學研究院天津蔬菜研究所選育。

1.1.2 培養基 培養基主要有阿須貝氏培養基（0.2 g KH2PO4、0.2 g MgSO4·7H2O、0.2 g NaCl、5 g CaCO3、10 g甘露醇、0.1 g CaSO4·2H2O、18 g瓊脂、1 000 mL水，pH值6.8～7.0）、解鉀菌選擇培養基（5 g蔗糖、2 g Na2HPO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.005 g FeCl3、0.1 g CaCO3、1 g鉀長石（400目）、18 g 瓊脂、1 000 mL水）、解鉀菌復篩培養基[10 g蔗糖、1 g Na2HPO4、0.5 g（NH4）2SO4、1 g MgSO4·7H2O、0.2 g酵母粉、0.1 g NaCl、0.1 g CaCO3、0.005 g FeCl3、5 g鉀長石、1 000 mL水]。

1.1.3 主要儀器與試劑 Taq聚合酶、DNA marker、PCR產物純化試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;引物合成和DNA測序由上海英駿生物技術有限公司完成，其他試劑為國產分析純。電泳儀PCR儀購自Bio-RAD公司，紫外可見分光光度計均購自島津企業管理（中國）有限公司。

1.1.4 供試土壤 盆栽土壤取自邢臺市信都區漿水鎮前南峪村山區土壤，其理化性質：有機質含量為24.13 g/kg，全氮含量為1.43 g/kg，全磷含量為0.91 g/kg，全鉀含量為20.03 g/kg，速效氮含量為89.15 mg/kg，速效磷含量為47.15 mg/kg，速效鉀含量為 119 mg/kg，pH值為7.3。

1.2 試驗方法

1.2.1 解鉀菌的分離篩選 從邢臺等地采集共75份土樣，取10 g土樣加入到含90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩培養30 min，將土壤懸液稀釋103、104、105倍，取 100 μL 土壤懸液涂布在阿須貝培養基和解鉀菌選擇性培養基中，30 ℃培養3～4 d，挑取圓形、透明、表面濕潤黏稠的大菌落，劃線純化3次，將純培養菌株于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 解鉀菌解鉀能力的測定 采用解鉀菌復篩培養基，按5%的接種量接種D600 nm值為1.5的各菌株發酵液，28 ℃、180 r/min培養15 d，于培養3、6、9、12、15 d 采用原子吸收法測定發酵液中的可溶性鉀含量。

1.2.3 解鉀菌32-2的鑒定 在解鉀菌選擇培養基進行菌株培養，48 h觀察菌落形態。（1）菌株形態和生理生化鑒定。參照文獻[10]對菌株進行形態觀察和生理生化試驗。（2）菌株16S rDNA鑒定。采用通用引物27F：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）和1492R：（5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′），用菌落PCR擴增菌株的16S rDNA選用擴增體系（25 μL）：10×Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，25 pmol/μL 引物各 0.5 μL，Taq 0.3 μL，ddH2O 17. 2μL。反應條件：94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，循環30次;72 ℃終末延伸 10 min，4 ℃保溫。

PCR產物經回收試劑盒純化，送上海英駿生物技術有限公司進行測序，測序結果提交NCBI數據庫中進行序列比對分析，選取同源性較高的序列，利用MEGA 5.0軟件，構建菌株系統發育進化樹。

1.2.4 解鉀菌對黃瓜種子和幼苗的促生效果 挑選籽粒飽滿的黃瓜種子，用75%乙醇表面消毒 30 s，蒸餾水洗滌3～4遍，25 ℃恒溫培養箱中浸種24 h，然后置于鋪有滅菌濕紗布的培養皿上，室溫下催芽。待黃瓜種子整齊發芽后，播種于50孔塑料穴盤中，盤中裝有經2次高壓蒸汽滅菌的山區菜園土，試驗分3個處理：處理1，菜園土中澆灌濃度為1×108 CFU/mL 32-2菌懸液;處理2，澆灌濃度為1×108 CFU/mL 10013菌懸液;處理3，清水對照（CK）。將解鉀菌接于發酵培養基中，25 ℃、180 r/min 振蕩培養48 h。離心發酵液，去除上層液體，用無菌水稀釋菌體，混勻即為所需菌懸液。10 kg 菜園土加入菌懸液1 L，每盤播種50粒黃瓜種子，黃瓜幼苗置于光照培養箱內，溫度為28 ℃，相對濕度為65%，光周期為12 h/12 h。第4天計算發芽勢，第7天計算發芽率，待種子發芽結束后分別從各處理中選取12組發育基本一致的黃瓜幼苗，每組5株，培養3周，測量黃瓜莖粗、株高、鮮質量和干質量，并計算植株壯苗指數。

1.2.5 解鉀菌對黃瓜產量及品質的影響 黃瓜幼苗移栽至口徑為50 cm、高為35 cm的花盆中，每盆定植1株，盆中裝有經2次高壓蒸汽滅菌的山區菜園土，試驗于河北省石家莊鹿泉區河村溫室大棚中進行。采用1×108 CFU/mL 32-2和10013菌懸液灌根處理，用量為1 L/株，黃瓜生長期內每2周處理1次，共處理9次，對照為清水灌根。測定黃瓜的果實橫徑、縱徑、平均單果質量和單株產量以及可溶性糖、可溶性蛋白、維生素C、可溶性固形物含量。其中，可溶性固形物含量采用手持折光儀測定;可溶性糖含量采用蒽酮比色測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍染色法測定;維生素C含量采用2，6-二氯靛酚滴定法[11]測定。

1.3 數據統計與分析

數據采用Excel 2010進行處理，用DPS統計分析軟件進行差異分析。

2 結果與分析

2.1 解鉀菌的分離篩選

在阿須貝氏培養基和解鉀選擇培養基平板上進行解鉀菌株的篩選，共篩選出7株解鉀菌株（圖1），分別命名為21-2、Z14-3、63-4、31-4、BM-1、32-2、64-6。對初篩的7株菌株進行搖瓶解鉀試驗，分別測定培養3、6、9、12、15 d發酵液中的可溶性鉀含量，其中接種邢臺油麥菜地中分離到的菌株32-2，發酵15 d時發酵液中可溶性鉀含量為37.77 mg/L，是對照中可溶性鉀含量的16.22倍。

2.2 解鉀菌32-2的鑒定

在解鉀選擇培養基上進行32-2菌株培養，48 h 觀察菌落形態，該菌株菌落呈圓形、邊緣整齊、透明凸起、表面濕潤、菌落黏稠、菌落挑起時有彈性、可拉成絲。用顯微鏡觀察菌體發現，該菌呈革蘭氏陰性，菌體橢圓形，產生橢圓形芽孢和肥大的莢膜。由表1可以看出，對菌株32-2進行16S rDNA擴增得到1條1 500 bp左右的條帶，將其測序后的序列信息提交給NCBI，構建菌株系統發育進化樹（圖2）。可以看出，32-2與草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti） strain ORS1044（LMG 15285）聚于同一個支上，序列相似性達99%，結合形態觀察和生理生化特性，32-2初步鑒定為草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）菌株。

2.3 解鉀菌32-2對黃瓜種子和幼苗的促生效果

發芽勢是指種子發芽達到高峰期的發芽率，是衡量種子發芽整齊程度的指標。由表2可知，在濃度為1×108 CFU/mL的32-2和10013處理下黃瓜發芽率均顯著高于對照，而32-2處理的發芽率比10013處理的高出3.93%，發芽勢高出7.97%。

由表3知，32-2處理的黃瓜幼苗，其株高、地下鮮質量、地上干質量、壯苗指數、干質量根冠比、根系活力等指標均顯著高于對照，且該處理的黃瓜幼苗株高、地下鮮質量、地上干質量、干重根冠比、根系活力等指標也顯著高于10013處理的黃瓜幼苗。

2.4 解鉀菌對黃瓜產量及品質的影響

通過測量黃瓜果實橫徑、縱徑、單果質量、產量發現，32-2處理后果實的橫徑、縱徑、單果質量、產量均顯著高于對照，而10013處理后的果實橫徑、產量分別與對照無顯著差異。32-2產量比對照增產8.41%，而10013處理的黃瓜產量只比對照增產0.24%（表4）。通過測量黃瓜各項品質指標發現，32-2處理后黃瓜的可溶性固形物、可溶性糖、維生素C、可溶性蛋白含量均顯著高于對照，而10013處理后的黃瓜品質各項指標與對照無顯著性差異（表5）。

2.5 解鉀菌對土壤養分狀況的影響

施用菌株32-2和10013后種植黃瓜的土壤有機質和速效鉀含量均有一定程度提高。可見，微生物菌劑對改善土壤養分具有較好的效果（表6）。

3 結論與討論

本試驗發酵條件是在實驗室條件下應用搖瓶試驗完成的，菌株如果應用到實際生產，還應綜合考慮各方面因素，在保證菌株效果的前提下，選用廉價原料和合適的培養條件，使菌劑的生產效益最大化。吳凡等在對桑樹根際解鉀菌進行鑒定時，發現了2株具有較強解鉀能力的根瘤菌（FK11和FK8）[12]。有研究表明，接種根瘤菌對相思苗木的生長有顯著的促進作用，并明顯提高土壤有效鉀的含量[13]。張亮等通過液體培養試驗研究了8株菜豆根瘤菌對土壤鉀的活化作用。由此可知，根瘤菌除具有固氮能力，某些菌株還可以活化土壤中的無效鉀，從而提高土壤鉀的生物有效性，達到對植物促生的效果[14]。本試驗獲得的高效解鉀菌株 32-2 可高效分解鉀礦石中的鉀元素，發酵15 d時發酵液中可溶性鉀含量為37.77 mg/L，是對照中可溶性鉀含量的16.22倍。同時，對黃瓜有顯著的促生作用，黃瓜幼苗濃度為1×108 CFU/mL的32-2處理下發芽率均顯著高于對照，且處理后的黃瓜幼苗株高。地下鮮質量、地上干質量、壯苗指數、干質量根冠比、根系活力等指標均顯著高于對照，同時果實的產量和品質各項指標均顯著高于對照。但是，中華草木樨根瘤菌32-2的解鉀機制和促生機制還有待進一步研究。

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