黃地老虎成蟲對15種植物揮發物的電生理和行為反應

李 琳，修春麗，路 偉，陸宴輝

(1. 新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830091；2. 中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3. 中國農業科學院茶葉研究所，杭州 310008)

0 引 言

【研究意義】黃地老虎Agrotissegetum(Denis et Schiffermüller)屬鱗翅目夜蛾科，幼蟲俗稱切根蟲、土地蠶等，在我國分布廣泛，其中華北、新疆、內蒙古、甘肅、青海等地的發生比較嚴重[1]。黃地老虎是一種多食性害蟲，寄主植物多達100余種，主要危害棉花、小麥、玉米、高粱、馬鈴薯、甜菜、苜蓿、以及多種瓜類和蔬菜等作物。黃地老虎1～2齡幼蟲為害較輕，自3齡以上幼蟲為害逐漸加重，能咬斷幼苗近地面的莖部，造成作物整株死亡和田間缺苗斷壟。黃地老虎幼蟲晝伏夜出，白天生活在土壤中，夜晚出來取食為害，給防治帶來了很大的難度，亟待尋找和發展新的防治方法。【前人研究進展】植食性昆蟲主要利用植物釋放的揮發性物質來辨別寄主和非寄主、以及偏好寄主和普通寄主，植物揮發物在昆蟲寄主植物的選擇過程中常起著決定性作用[2-4]。每種植物的揮發物組分種類眾多，通過對吸引昆蟲的活性組分進行鑒定、篩選與利用，可以研發昆蟲食誘劑產品及其行為調控措施[5]。目前，夜蛾、實蠅等多類害蟲的食誘劑已被成功研發[5,6]，并在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)等一些重要害蟲的成蟲種群監測與防治中取得明顯效果[7-9]。前期研究發現，在眾多寄主植物中，黃地老虎成蟲偏好在棉花、苘麻、芝麻、龍葵和灰藜等寄主植物上產卵，表現出了明顯的寄主偏好性[10-11]，但黃地老虎對寄主植物揮發物及其組分的電生理和行為反應缺乏研究?！颈狙芯壳腥朦c】遴選棉花、苘麻等黃地老虎寄主植物中常見的15種揮發性物質，通過EAG測試黃地老虎雌性成蟲對每種物質的電生理反應，同時通過風洞測定對各種物質的選擇行為?！緮M解決的關鍵問題】測試黃地老虎雌性成蟲對不同揮發物的電生理以及行為反應，驗證植物揮發物在其寄主選擇中的重要功能，并篩選出對黃地老虎有顯著吸引作用的揮發性物質，為研發成蟲食誘劑奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試昆蟲

黃地老虎為室內種群，采用中國農業科學院植物保護研究所自行研制的人工飼料進行繼代飼養，養蟲室條件為溫度(26±1)℃、濕度60%±10%RH、光照L∶D=14∶10 h。選擇形態完整且健康活躍的個體作為試蟲。

1.1.2 供試樣品

選用棉花、苘麻等黃地老虎寄主植物中常見的15種揮發物，列出各種揮發物及參照化合物正庚醛的標準樣品。表1

表1 供試化合物Table 1 Information on tested compounds

1.1.3 供試儀器

觸角電位儀EAG(Syntech，荷蘭)由電極固定器、觸角固定器PRG-2、探頭數據采集控制器 IDAC-2、氣味刺激控制裝置 CS-55 和觸角電位記錄顯示輸出裝置組成。

風洞裝置為自行設計，由透明有機玻璃制成，長210 cm、高90 cm、寬80 cm。氣流設定為0.3 m/s，周圍環境保持黑暗，僅開啟風洞上方的紅光燈，室內溫度保持(25±1)℃、濕度(60±5)%RH。

1.2 方 法

1.2.1 植物揮發物的EAG測試

用已知對地老虎類害蟲成蟲具有較好引誘作用的綠葉氣味物質正庚醛作為參照[12]，進行觸角電位反應測定。將每種揮發物標準化合物分別配制為5個濃度梯度，依次為：100、10、1、0.1、0.01 ng/mL，配制100 ng/mL的稀釋液，依次稀釋10倍，配置完成其余濃度梯度的稀釋液。將配制完成的5種濃度梯度的稀釋液用移液槍取10 μL，分別滴加到對折的濾紙條(0.5 cm寬×5 cm長)上，之后迅速的把濾紙條放進巴斯德玻璃滴管內，兩端用錫箔紙封好，制備好觸角后作為刺激味源使用。滴加有100 ng/mL正庚醛的濾紙條做為參照，滴加10 μL石蠟油的濾紙條做為對照。

將2～4日齡活躍的黃地老虎成蟲凍暈后其置于解剖鏡下，用解剖剪沿黃地老虎單根觸角基部剪下。檢查觸角的完整性，觸角完整即可進一步試驗。用雙面刀片將此觸角尖端切去一小節，將參考電極(涂抹導電膠)與觸角基部連接，放置到EAG微操做臺上，將觸角的尖端與記錄電極的毛細管相連，EAG系統通過兩個電極中的銀絲相連通。將EAG微操作臺整體搬運至氣相色譜玻璃管出樣口處，等待1～3 min直到觸角電位信號穩定，開始記錄觸角電位反應值。每頭黃地老虎先測試對照化合物(石蠟油)，然后測試參照化合物(正庚醛)，再測試供試揮發物，測試揮發物按照從低濃度到高濃度依次進行測試，再對參照和對照化合物進行刺激測試。將巴斯德滴管的尖端通過管壁上的小孔(距離管口約11 cm)插入到鋼管中(深度約為3 mm)，每次刺激時間為0.5 s，兩次刺激的間隔時間30 s，每個物質各重復10次。

EAG儀器通過IDAC-2信號采集器與計算機相連。觸角距離鋼管口大約3 mm，600 ml/min的氣流經過活性碳和加濕瓶進入鋼管(長度14 cm，內徑8 mm)然后攜帶刺激源吹向觸角。試驗過程中室內溫度保持(25±2)℃，濕度(70±5)%RH。

1.2.2 植物揮發物的風洞測定

將植物揮發物配置成濃度為100 μg/mL的稀釋液，用移液槍取10 μL配制好的溶液滴加到濾紙條(寬0.5 cm×長5 cm)上，放置于裝置上風口的試驗臺上，試驗臺高30 cm，距上風端20 cm。試驗用雌性成蟲單頭引入風洞裝置下風口的觀察記錄黃地老虎成蟲的起飛方向：逆風(飛向滴有活性物質的濾紙條)且越過裝置二分之一處，和順風(遠離滴有活性物質的濾紙條)，并分別記錄試蟲選擇時間。若黃地老虎雌性成蟲靜止不動3 min，或起飛后觸及風洞任意壁且停留時間超過5 s即結束試驗。每種物質共測試60頭雌蟲，每組測試20頭，重復3次。

1.3 數據處理

在每種測試化合物刺激之前和之后，對照和標準化合物的EAG振幅值取平均值。然后根據公式(CT-CK)/(CF-CK)計算相對EAG響應值，CT：被測刺激的EAG振幅值；CK：對照(石蠟油)的平均EAG振幅值；CF：參照物質(正庚醛)的EAG平均振幅值。風洞試驗用X2檢驗黃地老虎成蟲在兩個方向間是否呈假設H0為50：50的理論分布，計算X2的值和相應的顯著性水平P值。在風洞中靜止不動的黃地老虎雌性成蟲不計入統計分析內。

2 結果與分析

2.1 黃地老虎雌性成蟲對15種植物揮發物的電生理反應

研究表明，黃地老虎雌性成蟲對4種測試植物揮發物均沒有明顯的EAG反應，但對其余11種植物揮發物產生了較強的EAG反應。黃地老虎雌性成蟲對癸烷、對乙基苯乙酮、2-甲基壬烷和3,3-二甲基辛烷未產生明顯的EAG反應，且隨著揮發物濃度的增加，EAG相對反應值基本沒有變化。黃地老虎雌性成蟲對1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、羅勒烯和β-蒎烯的EAG反應隨著揮發物濃度的增加而增加，濃度較小時基本不產生電生理反應，在最大測試濃度100 μg/ml時產生強烈的電生理反應，其中，黃地老虎雌成蟲對丁酸丁酯和壬醛的反應相對于其它揮發物更強烈。圖1

注：1: 1,2-二乙苯; 2: 1,4-二乙苯; 3: 丁酸丁酯; 4: 癸烷; 5: 4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯; 6: 對乙基苯乙酮; 7: 桉葉油醇; 8: 乙酸葉醇酯; 9: 芳樟醇; 10: 2-甲基壬烷; 11: β-月桂烯; 12: 壬醛; 13: 3,3-二甲基辛烷; 14: 羅勒烯; 15: β-蒎烯

2.2 黃地老虎雌性成蟲對15種植物揮發物的行為反應

研究表明，1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、癸烷、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、對乙基苯乙酮、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、3,3-二甲基辛烷、羅勒烯和β-蒎烯14種寄主植物揮發物對黃地老虎雌蟲具有顯著的吸引作用，成蟲逆風趨向供試揮發物的數量顯著高于順風趨向對照石蠟油的數量(1,2-二乙苯：X2=7.02，df=1，P=0.008；1,4-二乙苯：X2=3.88，df=1，P=0.049；丁酸丁酯：X2=8.82，df=1，P=0.003；癸烷：X2=7.02，df=1，P=0.008；4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯：X2=14.02，df=1，P<0.001；對乙基苯乙酮：X2=29.26，df=1，P<0.001；桉葉油醇：X2=4.34，df=1，P=0.037；乙酸葉醇酯：X2=4.50，df=1，P=0.034；芳樟醇：X2=6.28，df=1，P=0.012；β-月桂烯：X2=33.02，df=1，P<0.001；壬醛：X2=4.32，df=1，P=0.038；3,3-二甲基辛烷：X2=13.28，df=1，P<0.001；羅勒烯：X2=14.80，df=1，P<0.001；β-蒎烯：X2=13.26，df=1，P<0.001)。其中，β-月桂烯和對乙基苯乙酮在風洞中對黃地老虎雌蟲的吸引力最強，在測試的60頭黃地老虎雌蟲中，分別有50頭和46頭雌蟲逆風趨向β-月桂烯和對乙基苯乙酮。但2-甲基壬烷處理中，黃地老虎成蟲的趨向行為不明顯(X2=0.62，df=1，P=0.431)。圖2

注：1: 1,2-二乙苯; 2: 1,4-二乙苯; 3: 丁酸丁酯; 4: 癸烷; 5: 4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯; 6: 對乙基苯乙酮; 7: 桉葉油醇; 8: 乙酸葉醇酯; 9: 芳樟醇; 10: 2-甲基壬烷; 11: β-月桂烯; 12: 壬醛; 13: 3,3-二甲基辛烷; 14: 羅勒烯; 15: β-蒎烯

3 討 論

目前關于黃地老虎的研究，主要集中在生物學特性、發生與防治以及性信息素鑒定等方面[13-16]。試驗通過EAG技術測試了黃地老虎雌性成蟲對棉花等主要寄主植物中幾種常見揮發物的觸角電生理反應，并在風洞中篩選出了對黃地老虎成蟲具有較強引誘作用的活性物質，證實了黃地老虎成蟲對植物揮發物的嗅覺識別功能。Hallberg研究了黃地老虎成蟲觸角上的感器類型，共4種，其中包括在各種昆蟲中主要行使嗅覺識別功能的毛形感器和錐形感器[17]，為研究結果提供了直接證據。研究為黃地老虎植物源引誘劑及其行為調控技術的研發提供了理論依據并奠定了物質基礎。

EAG結果表明，黃地老虎雌性成蟲對一些植物揮發物的觸角電位值均隨濃度的升高而升高，這與許多鱗翅目其他昆蟲的研究結果相一致。例如，煙青蟲和棉鈴蟲對正己醇、(-)-里那醇等6 種植物揮發物的EAG劑量反應，均隨著刺激物質濃度的增大而增強[18]；雌性桃蛀螟觸角對玉米花絲氣味物質1-己醇、1-庚醇、β-蒎烯和β-紫羅酮的EAG反應隨濃度的增加，反應強度增加迅速[19]。昆蟲的觸角離體后，隨時間的推移觸角活性會逐漸下降，因此本試驗挑取活躍的黃地老虎成蟲進行觸角電位試驗，剪下后立即進行EAG測試，保證觸角的活性。在進行EAG試驗時，觸角反應的絕對值受多種因素的影響，如載氣流速、溫度、前次反應對后次反應、樣品管與觸角之間的距離等因素的影響。試驗中采用參照物質正庚醛標定觸角的活性，測試得到的觸角電位值是對于參照物質的相對值，可以有效地消除上述因素的影響。

風洞試驗發現對乙基苯乙酮、癸烷和3,3-二甲基辛烷對黃地老虎雌性成蟲的引誘能力明顯，而EAG測試時不能引起黃地老虎成蟲觸角明顯的電位反應。電生理和行為反應的不一致的現象，在植食性昆蟲的嗅覺研究中經常發現[20-22]。昆蟲對植物揮發物的反應行為常受到自身生理狀況、環境因素等各方面因素的綜合影響，這往往是兩者結果不一致的原因所在。除對乙基苯乙酮、癸烷和3,3-二甲基辛烷外，黃地老虎對其余物質情況的EAG反應強度和風洞行為趨性基本一致。黃地老虎雌性成蟲對不同揮發物的風洞試驗中，觀察到多數逆風飛向測試物質一側，但很少降落在引誘物質上，可能是由于測試的是單一活性物質，對成蟲的引誘能力不如植物本身釋放的多組分揮發物。不同揮發物組分之間可能存在著增效等不同作用，有待進一步研究，另外還需進行單一和混配活性物質的田間引誘效果驗證，這更有助于對吸引效果的確認和評估。

另外，顏色、大小和輪廓等固有性質也是影響昆蟲辨別植物的強烈信號，昆蟲能夠利用這些視覺信號搜索寄主；遠距離時，昆蟲主要依靠植物輪廓定位寄主，近距離時，寄主的大小，顏色和形狀發揮重要作用[23,24]。顏色信號在黃地老虎寄主選擇行為的作用與功能，同樣值得進一步探討。

4 結 論

通過EAG測試黃地老虎雌性成蟲對棉花等主要寄主植物中常見的15種揮發物組分的電生理反應，對1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、羅勒烯和β-蒎烯產生了明顯反應，對測試的最大濃度100 μg/mL的反應最強烈。利用風洞測定黃地老虎雌性成蟲對15種植物揮發物的行為選擇，其中1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、癸烷、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、對乙基苯乙酮、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、3,3-二甲基辛烷、羅勒烯和β-蒎烯對成蟲有顯著的引誘作用。