胰島素受體底物1對成骨細胞分化的影響及機制

王 娜，劉 暢，劉斯靜，WANG Xiao，李玉坤,薛 鵬*

(1.河北醫科大學第三醫院內分泌科，河北省骨科生物力學重點實驗室，河北 石家莊 050051；2.河北醫科大學期刊社，河北 石家莊 050017；3.約翰·霍普金斯醫學院肌肉與骨骼研究中心，美國 馬里蘭 21212)

骨組織可持續再生，但在病理狀態下這種自我修復能力會被降低。糖尿病等疾病破壞骨轉換平衡，導致骨組織再生障礙，骨修復能力受損，骨微結構異常而易于發生脆性骨折[1]。骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等[2]，其向成骨細胞分化能力在骨質疏松癥發病中具有重要意義。BMSCs分化方向受多種因素調節，尤其是轉錄后調節因子。其中，具有盤狀同源區域結合序列的轉錄共活化因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)具有廣泛生物學功能，參與調節BMSCs成骨-成脂分化平衡[3]。TAZ通過結合Runt相關轉錄因子2(runt related transcription factor 2，RUNX2)促進成骨分化，或結合過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)抑制成脂分化[4-5]。作為胰島素通路的樞紐因子，胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)在糖尿病、骨質疏松癥中的作用舉重若輕。目前，關于IRS-1對BMSCs分化的影響尚有爭議。據報道，IRS-1胞內蓄積有利于細胞向成軟骨方向分化[6]。也有其他學者認為，IRS-1是細胞分化的抑制因子[7-8]。據此，本研究將進一步探索IRS-1/TAZ信號轉導調節BMSCs向成骨細胞分化的潛在機制，為干細胞分化調控程序提供新靶點。報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 3月齡SPF級雌性未受孕SD(Sprague Dawley)大鼠15只，用于動物實驗；4周齡SD大鼠9只，用于BMSCs的原代培養。實驗動物購于河北醫科大學實驗動物中心，動物合格證書號 1708080。

1.2動物分組及骨質疏松模型的構建 將15只3月齡SD大鼠隨機分為對照組、假手術組、去卵巢手術(ovariectomy，OVX)組，每組5只。去卵巢手術操作步驟如下：大鼠禁食禁水12 h后，對其進行麻醉，于俯臥位對大鼠卵巢進行定位，消毒手術部位，依次剪開皮膚、肌肉及筋膜，分離脂肪團，手術結扎輸卵管，完整切除雙側卵巢，止血并逐層縫合。假手術組僅切除卵巢等體積大小脂肪組織，保留卵巢。術后3 d內連續應用抗生素預防感染。術后12周用于后續實驗。

1.3大鼠BMSCs的原代培養及成骨分化 將4周齡SD大鼠CO2麻醉后處死，用75%乙醇浸泡5 min。在無菌條件下取雙側股骨，剪除股骨近端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM培養基反復沖洗骨髓腔，用1 mL注射器反復抽吸制成細胞懸液。細胞取出后，以5×106/cm2的密度接種于含12%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養基中，放入細胞培養箱中培養。原代細胞達到80%融合后傳代，P3代細胞用于后續實驗。應用成骨誘導培養基(DMEM含12%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L抗壞血酸)誘導BMSCs向成骨細胞分化。

1.4微型電腦斷層成像(micro-computed tomography，μCT)分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h。應用高分辨率μCT (SkyScan,1176)對股骨進行掃描分析(65 kv,153 μA),分辨率9.0 μm/pixel。應用重建軟件(NRecon,v1.6,SkyScan)、數據分析軟件(CTAn,v1.9,SkyScan)和三維模型可視化軟件(CTVol,v2.0,SkyScan)對掃描圖像進行處理和分析。分析指標包括骨小梁體積分數(bone volume fraction,BV/TV)，骨小梁厚度(trabecular thichness,Tb.Th)和骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.5免疫熒光分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h；0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣3周，4 ℃，搖床；應用8%明膠包埋，制作20 μm冰凍切片。將冰凍切片于37 ℃烘干，浸泡于PBS液15 min，5% BSA封閉1 h，一抗孵育(抗大鼠IRS-1，Abcam)，4 ℃，過夜；TBST清洗，熒光二抗孵育1 h，TBST清洗，DAPI封片。采用Image J軟件對熒光強度進行統計分析。

1.6質粒轉染 課題組在前期實驗中已經自行構建IRS-1高表達質粒(pCMV-IRS-1)[9]。本實驗構建了分別用于敲除IRS-1和TAZ表達的質粒，即嵌入敲除IRS-1表達的小干擾RNA(SiIRS-1)的質粒，和嵌入敲除TAZ表達的小干擾RNA(SiTAZ)的質粒(上海吉凱基因化學有限公司)。應用脂質體3 000(Thermo)對BMSCs進行轉染。細胞轉染24 h后，更換為成骨誘導培養基進行培養。同時為上述實驗設立對照，未進行質粒轉染組設置為“空白對照組”，轉染空白質粒組作為“陰性對照組”。

1.7茜素紅染色 將細胞接種至35 mm塑料培養皿中，成骨誘導基培養14 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min。蒸餾水清洗3次后，0.1%茜素紅染色，37 ℃，30 min。蒸餾水清洗3次后，顯微鏡下拍照。然后，應用10%氯化十六烷基吡啶對茜素紅進行脫色，室溫，30 min。應用酶標儀(562 nm)讀取其吸光度值。

1.8蛋白免疫印跡(Western blot) 將細胞接種至60 mm塑料培養皿中，成骨誘導基培養3 d。利用RIPA裂解液提取蛋白。應用12% SDS-PAGE膠對蛋白進行電泳分離后，采用半干法將其轉移至PVDF膜。5%牛奶封閉，37 ℃，室溫。一抗孵育(抗TAZ，Cell Signaling；抗RUNX2，Boster；抗骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)，Boster；抗GAPDH，Bioworld)，4 ℃，過夜。二抗37 ℃孵育1 h。應用image J軟件分析蛋白條帶灰度值，并計算目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值。

1.9統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同組別大鼠股骨μCT和IRS-1免疫熒光染色比較 采用μCT對大鼠股骨的松質骨相關指標進行分析，結果顯示，3組間BV/TV值、Tb.Th值、Tb.Sp值差異有統計學意義(P<0.05)；OVX組BV/TV值、Tb.Th值低于對照組和假手術組，Tb.Sp值高于對照組和假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組和假手術組BV/TV值、Tb.Th值、Tb.Sp值差異無統計學意義(P>0.05)。采用免疫熒光染色定量分析大鼠股骨IRS-1的表達量，結果顯示，3組間IRS-1+熒光強度百分比差異有統計學意義(P<0.05)；OVX組IRS-1+熒光強度百分比低于對照組和假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組和假手術組IRS-1+熒光強度百分比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表1。

圖1 不同組別大鼠股骨μCT結果和IRS-1熒光染色的比較

表1 不同組別大鼠股骨μCT定量分析和IRS-1免疫熒光染色定量分析比較Table 1 The quantitative analysis of μCT results of rat femurs and IRS-1 immunofluorescence results in different groups

2.2IRS-1基因高表達對茜素紅染色結果和成骨分化相關蛋白表達的影響 BMSCs成骨誘導14 d后，對其進行茜素紅染色，結果顯示，應用pCMV-IRS-1轉染后，IRS-1組BMSCs的鈣結節明顯多于空白對照組和陰性對照組(圖2A)。進一步對茜素紅吸光度進行定量分析后發現，3組間茜素紅吸光度差異有統計學意義(P<0.05)；IRS-1組茜素紅吸光度高于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組茜素紅吸光度差異無統計學意義(P>0.05)。BMSCs成骨誘導3 d后，采用Western blot方法分析成骨分化相關蛋白TAZ、RUNX2、OCN的表達水平，結果顯示，IRS-1組TAZ、RUNX2、OCN的表達量明顯高于空白對照組和陰性對照組(圖2B)。進一步對蛋白條帶灰度值進行定量分析后發現，3組間TAZ、RUNX2、OCN的表達量差異有統計學意義(P<0.05)；IRS-1組TAZ、RUNX2、OCN的表達量高于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組TAZ、RUNX2、OCN的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表2。

圖2 IRS-1基因高表達對茜素紅染色結果和成骨分化相關蛋白表達的影響

表2 IRS-1基因高表達對茜素紅染色和TAZ、RUNX2、OCN表達影響的定量分析 Table 2 The quantitative analysis of the effects of high expression of IRS-1 mRNA on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins

2.3IRS-1或TAZ基因敲除對茜素紅染色結果和成骨分化相關蛋白表達的影響 茜素紅染色結果提示， SiIRS-1組和SiTAZ組的鈣結節明顯少于空白對照組和陰性對照組(圖3A)。進一步對茜素紅吸光度進行定量分析后發現，4組間茜素紅吸光度差異有統計學意義(P<0.05)；SiIRS-1組和SiTAZ組茜素紅吸光度低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組、SiIRS-1組和SiTAZ組差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot結果顯示，SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ、RUNX2、OCN的蛋白表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組(圖3B)。進一步對蛋白條帶灰度值進行定量分析后發現，4組間TAZ、RUNX2、OCN的表達量差異有統計學意義(P<0.05)；SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ、RUNX2、OCN的表達量低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組、SiIRS-1組和SiTAZ組間TAZ、RUNX2、OCN的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

圖3 IRS-1或TAZ基因敲除對茜素紅染色結果和成骨分化相關蛋白表達的影響

表3 IRS-1或TAZ基因敲除對茜素紅染色和TAZ、RUNX2、OCN表達影響的定量分析Table 3 The quantitative analysis of the effects of IRS-1 or TAZ knockout on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins

3 討 論

骨質疏松癥是一種以骨形成受損、骨吸收增加為特征的骨代謝疾病，骨量降低、骨微結構損害，骨折風險明顯增加。近來，學者發現基因修飾干細胞可促進BMSCs向成骨細胞分化，改善骨細胞功能，在來源上增加骨形成[10]。同時，體外培養BMSCs在骨生理學研究領域廣為應用，可作為干細胞基因修飾的種子細胞。本研究結果顯示，IRS-1和TAZ之間存在相互作用，這種相互作用是調節BMSCs向成骨細胞定向分化的潛在機制，是聯絡糖尿病和骨質疏松癥的關鍵因素，可作為基因修飾干細胞治療的新靶點。

IRS-1是胰島素信號轉導的船塢蛋白，在胰島素受體結合SH2結構蛋白中起錨定作用。同時，IRS-1本身含有21個酪氨酸磷酸化位點，可直接與SH2結構蛋白結合，進而激活下游信號通路[11]。此外，IRS-1還包含絲氨酸/蘇氨酸殘基，可被絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化，抑制胰島素受體酪氨酸蛋白激酶活性，進而參與調節細胞增殖、生長、分化等多種功能[12]。近來，研究發現IRS-1在成骨細胞和軟骨細胞中表達，而不在破骨細胞表達[13-14]。進一步研究，IRS-1基因特異性敲低小鼠表現為成骨分化抑制，成骨細胞數量減少，導致骨形成率降低[15]。可見，IRS-1不僅是胰島素抵抗的候選基因，在骨代謝中的作用也不容忽視。但是，目前關于IRS-1對細胞分化的作用尚存爭議。IRS-1是一種細胞分化抑制因子。Xi等[16]體內外實驗發現，敲低IRS-1減少p53/Kruppel樣因子4復合體形成，促進血管平滑肌細胞增殖和分化。與此相反，多數學者認為IRS-1是一種細胞分化促進因子[17]。這可能是因為，不同細胞類型中，IRS-1對細胞分化的作用不盡相同。成肌細胞中研究發現，IRS-1是成肌細胞分化的必需因子，敲低IRS-1成肌細胞分化減少[18]。本研究部分結果表明，IRS-1是間充質干細胞成骨分化的必需因子，敲低IRS-1則TAZ表達下調，成骨分化抑制；過表達IRS-1則TAZ表達上調，成骨分化加強。

另一方面，本研究還發現了IRS-1和TAZ之間的密切聯系。TAZ是調節BMSCs成骨-成脂分化平衡的關鍵因子。最初，TAZ作為14-3-3結合蛋白被發現，其89位絲氨酸位點磷酸化后可以與14-3-3結合，進而阻滯于細胞質[19]。TAZ在哺乳動物廣泛表達，與Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)有約50%同源性，且在拓撲結構上十分相似[20]。TAZ和YAP一樣具有轉錄激活功能，最先發現TAZ可分別與成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2及成脂分化關鍵轉錄因子PPARγ結合，激活RUNX2轉錄，抑制PPARγ轉錄活性，從而促進成骨分化而抑制成脂分化，即調節干細胞定向分化[21]。本研究首次發現了IRS-1和TAZ之間的相互作用，這種相互作用可能是IRS-1促進BMSCs向成骨細胞分化的潛在機制。

綜上所述，IRS-1可通過上調TAZ表達，促進BMSCs向成骨細胞分化。IRS-1/TAZ可能作為基因修飾干細胞治療糖尿病骨質疏松癥的新靶點。