基于代謝組學分析云南滇紅和墨紅玫瑰花色差異*

施 蕊，錢曉慧，欒云鵬，陳 黎，陳龍清△

（1.西南林業大學園林園藝學院，云南省功能性花卉資源及產業化技術工程研究中心，云南 昆明 650224；2.大理花之隱農業發展有限公司，云南 大理 671003）

近年來，大多數人對植物的次生代謝產物進行了的研究[1-3]。黃酮類化合物作為最大的次級代謝產物，有著重要的生物學功能，在植物的花瓣中可以產生大量的次生代謝產物，這不僅為花朵提供各種顏色和香味，促進受粉完成繁殖，還成為植物代謝組學中研究的理想模型系統[4]。中國的玫瑰品種很多，如苦水玫瑰[5]、中國玫瑰、墨紅[6]等，但是大部分可以食用的是重瓣玫瑰。因為單瓣玫瑰中單寧酸含量是重瓣玫瑰得幾十倍以上，多吃不宜。以前研究發現，滇紅和墨紅花色不同，口感也稍有不同，種植方式、生長周期與環境適應性也不同，但尚未研究兩種玫瑰花瓣中所含的黃酮類物質的組成、含量，以及黃酮類物質的代謝途徑有何差異。

墨紅Rosa L.‘Crimson Glory’和滇紅R.gallica L.‘Dianhong’屬于云南主栽的可食用重瓣玫瑰[7]。它們花瓣數多，而且層厚，可用來制茶，做醬汁，釀葡萄酒等[8]，也適合提取其色素以及糖類、蛋白質、微量元素等營養成分[9]。滇紅和墨紅花瓣的顏色是分別為紫色和紅色，植物的花色主要由3種類型的物質決定：類黃酮，類胡蘿卜素和生物堿[10]。黃酮類化合物是苯丙烷類化合物的次生代謝產物，可使花朵呈現粉紅色、紅色、藍色、紫色和黃色[11]。類胡蘿卜素的顏色范圍較廣，是形成黃色、橙色至紅色花的主要色素物質[12]。對整個植物代謝組的更全面了解將有助于理解不同花色植物中的色素化學及其相關的生物合成途徑[13]。黃酮具有清除羥基自由基，超氧陰離子自由基和脂質過氧自由基的能力，這表明許多黃酮具有促進人體健康的功能[14]。但是，并非所有的類黃酮及其作用都是有益的。一些類黃酮具有誘變和促氧化劑作用，并會干擾基本的生化途徑[15]。因此，采用代謝組學檢測方法探討了兩種食用玫瑰中黃酮類代謝組的差異，揭示玫瑰色差異的原因，為玫瑰花色的進一步開發和食品利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 供試材料墨紅（DH）和滇紅（ZY）玫瑰采自云南省大理白族自治州（N25°44′14″，E100°9′50″），海拔 1 970 m，見圖 1。

甲醇（Merck）、乙腈（Merck）、乙醇（Merck）為色譜純。

研磨儀（MM 400，Retsch）；微孔濾膜（0.22 μm pore size）；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chrom-atography，UPLC）；串聯質譜（Tandem mass spectrometry，MS/MS）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取 花瓣先真空冷凍干燥，再利用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀后稱取 100 mg的粉末，溶解于1.0 mL提取液（70%的甲醇水溶液）中；溶解后的樣品4℃冰箱過夜，期間渦旋3次，提高提取率；離心（轉速 10 000 g，10 min）后，吸取上清，用微孔濾膜過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2 樣品測定 液相條件主要為流動相：水相為超純水（加入0.04%的乙酸），有機相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脫梯度：0 min水/乙腈（95∶5 V/V），11.0 min為 5∶95 V/V，12.0 min 為 5∶95 V/V，12.1 min為 95∶5 V/V，15.0 min為 95∶5 V/V；流速0.4 mL/min；柱溫 40 ℃；進樣量 5 μL；質譜條件主要為：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度550 ℃，質譜電壓 5 500 V，簾氣（curtain gas，CUR）25 psi。

1.3 數據分析 基于UPLC-MS/MS檢測平臺，利用軟件Analyst 1.6.3處理質譜數據，數據庫和多元統計分析相結合，研究兩個品種之間的代謝組差異。

2 結果與分析

2.1 類黃酮代謝產物的定性和定量分析 對滇紅（ZY）和墨紅（DH）玫瑰花瓣進行類黃酮代謝組檢測，2組樣本中共檢測到174種黃酮類代謝產物。包括括67種黃酮類、37種黃酮醇類、11種黃烷酮類（二氫黃酮類）、14種花青素類、3種異黃酮類、12種黃烷醇類、7種黃酮碳糖苷類，14種原花青素類，2種查耳酮類，4種二氫黃酮醇類，3種鞣質類。

2.2 主成分分析 主成分分析（PCA）是一種多元統計分析工具，可以利用更少的主成分以顯示多個變量之間的內在的與結構[16]。PCA結果顯示3組之間黃酮類代謝物呈分離趨勢，組間呈聚集狀。在圖2中3個主要成分PC1，PC2和PC3分別為83.79%，7.55%和4.96%。結果表明，不同處理樣品之間存在明顯差異，組內穩定性良好。進而說明不同顏色的玫瑰中黃酮類化合物的積累方式也不同。

2.3 聚類相關性分析 聚類圖顯示，兩個品種之間的類黃酮積累模式存在顯著差異（圖3）。 DH（墨紅），mix01（滇紅和墨紅混樣 01），mix02（滇紅和墨紅混樣02）和mix03（滇紅和墨紅混樣03）分組為一個群集，ZY（滇紅）分組為另一群集（圖4）。

2.4 差異代謝物篩選及分析 差異代謝物篩選標準為VIP≥1且FC≥2和FC≤0.5。與對照相比，滇紅（ZY）產生的顯著差異代謝物共96種，其中上調差異代謝物73種，主要為黃酮醇類和黃酮類，其中異黃酮類、黃酮碳糖苷和鞣質這3類只參與上調（圖5）。下調差異代謝物23種，主要為黃酮醇類和黃酮類。如圖6，篩選出DH與ZY先相比差異倍數較大的代謝物，上調的前10依次分別為山奈酚-O-乙酰葡萄糖、二氫異鼠李素-O-戊糖苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷、金圣草黃素、異澤蘭黃素葡萄糖苷、楊梅黃酮3-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、5，7，4′，5′-四羥基-3′，6-二甲氧基黃酮、鷹嘴豆素7-O-葡萄糖苷（印度黃檀苷）、芹菜素、煅樹素（金合歡素-7-O-β-D-葡萄糖苷）；下調的前10依次分別為 原花青素 A3、木犀草素O-芥子酰己糖苷、金圣草黃素5-O-己糖苷、3-O-（5-葡糖基-3-羥基-3-甲基谷氨酸）-葡萄糖、（-）-表阿夫兒茶精、山奈酚-O-戊糖苷-O-二已糖苷、乙酰己糖苷異鼠李素、沒食子酸 O-阿魏酰己糖苷-O-己糖苷、異鼠李亭丙二酸己糖、異鼠李素O-乙酰己糖苷。

2.5 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析 利用KEGG數據[17]進行分析發現，差異代謝物不止參與1條代謝通路，有可能2條甚至多條代謝通路。（-）-表沒食子兒茶素參與了類黃酮生物合成和次生代謝產物的生物合成2條代謝途徑；牡荊素參與了類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成兩條代謝途徑；金合歡素參與了黃酮和黃酮醇生物合成1條代謝途徑；氯化天竺葵色素苷參與了花青素的生物合成1條代謝途徑；李屬異黃酮（櫻黃素）參與了異黃酮的生物合成1條代謝途徑；五羥黃酮參與了類黃酮生物合成1條代謝途徑；丁香亭參與了黃酮和黃酮醇生物合成1條代謝途徑；山奈酚參與了類黃酮生物合成、次生代謝產物的生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、花青素的生物合成、異黃酮的生物合成、苯丙烷的生物合成、代謝途徑5條代謝途徑；（-）-表阿夫兒茶精參與了類黃酮生物合成、次生代謝產物的生物合成2條代謝途徑；木犀草素參與了類黃酮生物合成、次生代謝產物的生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、代謝途徑4條代謝途徑；牡荊素-2-O-鼠李糖苷參與了黃酮和黃酮醇生物合成1條代謝途徑；鷹嘴豆素7-O-葡萄糖苷（印度黃檀苷）參與了異黃酮的生物合成1條代謝途徑；木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷參與了黃酮和黃酮醇生物合成1條代謝途徑；五沒食子酰葡萄糖參與了苯丙烷的生物合成一條代謝途徑；松黃烷酮參與了類黃酮生物合成1條代謝途徑；芹菜素參與了類黃酮生物合成、次生代謝產物的生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、異黃酮的生物合成、苯丙烷的生物合成、代謝途徑6條代謝途徑；金圣草黃素參與了黃酮和黃酮醇生物合成1條代謝途徑。

這些差異代謝物及相應的代謝途徑調控了云南滇紅和墨紅玫瑰顏色的差異。參與差異代謝物調節的代謝通路共有7條，分別是類黃酮生物合成、次生代謝產物的生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、花青素的生物合成、異黃酮的生物合成、苯丙烷的生物合成、代謝途徑。利用KEGG數據進行分析發現差異代謝物顯著富集在黃酮和黃酮醇生物合成，類黃酮生物合成和次生代謝物的生物合成（圖7）。其中注釋到黃酮和黃酮醇生物合成下的代謝物個數占被注釋上的代謝物總數比例最大，其次為類黃酮生物合成和次生代謝產物的生物合成（圖8）。

獲得以上結果后進一步將差異代謝物在KEGG圖上標注，類黃酮生物合成途徑中（-）-表沒食子兒茶素、牡荊素、山奈酚、木犀草素、松黃烷酮、芹菜素顯著上調；五羥黃酮和(-)-表阿夫兒茶精顯著下調（圖9）。黃酮和黃酮醇生物合成途徑中牡荊素、丁香亭、山奈酚、木犀草素、牡荊素-2-O-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、金圣草黃素、金合歡素顯著上調。這些不同的代謝產物和相應的代謝途徑調節滇紅和墨紅玫瑰顏色的差異（圖10）。

3 討論與結論

墨紅和滇紅含有174種類黃酮代謝物，黃酮類化合物大部分具有不同作用。異黃酮代謝性地來自黃烷酮，同時異黃酮是參與植物抗毒素生物合成的許多重要化合物的前體[18]。原花青素不僅對蛋白質代謝具有有益的作用，還能改善動物健康，并以可持續的方式改善農業[19]，它也可用于食品工業，例如葡萄籽中的原花青素，作用于抗氧化劑，抗微生物劑，抗肥胖，抗肥胖糖尿病，抗神經變性，抗骨關節炎，抗癌和保護心臟和眼睛等[20]。此外，差異代謝物芹菜素參與了6種代謝途徑。芹菜素的致畸變毒性與其他黃酮類化合物比相對較低，還能夠通過多靶點、多通路潛在改善炎癥、心血管疾病、神經退行性疾病、腫瘤和糖尿病等[21]?；ㄇ嗨厥撬苄陨兀粌H有色彩和營養特性，還具有作用于食品的感官特性[22]?？梢姷峒t和墨紅作為可食用的經濟作物，對于進一步發展為天然色素，成為有食用或保健功能食品，以及天然食材的調味料具有很大潛力。

通過功能注釋和差異代謝物的富集分析，筆者發現差異代謝物主要參與了黃酮和黃酮醇生物合成，類黃酮生物合成和次生代謝物的生物合成。黃酮和黃酮醇生物合成，類黃酮生物合成中差異積累的代謝產物可能是兩種玫瑰之間色差的關鍵。這為進一步解釋兩種玫瑰的花色、口感以及營養成分的不同提供了參考，也為這兩種玫瑰進一步進行花色遺傳育種奠定了基礎。

云南滇紅玫瑰與墨紅玫瑰是世界玫瑰花卉市場上比較著名的兩個品種，本研究發現，兩種花瓣中所含的黃酮類物質基本相同，但所含黃酮類物質比例、黃酮類代謝物以及黃酮類化合物的積累、代謝模式都有差異。本研究為兩種近親植物在食用玫瑰深加工方向的研究奠定了理論基礎。