芍藥甘草湯治療多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的網絡藥理學研究*

楚麗杰，劉 卉，羅文連，張 涵，楊寶玉

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院婦科，山東 濟南 250014）

高雄激素血癥（hyperandrogenemia，HA）是一種以雄激素過多為生化指標，月經異常、痤瘡、多毛、脫發等為臨床表現的疾病[1-2]。其誘因包括多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、腎上腺皮質增生、雄激素分泌性腫瘤等，約95%的HA婦女患有PCOS[3]。HA不僅是PCOS的病理學特征之一，也是其核心病因[4]，HA可抑制卵泡的發育和成熟，不能形成優勢卵泡，從而影響排卵與行經[5]，并且增加子宮內膜癌、糖尿病和心腦血管疾病的發生率。因此，對HA的干預成為PCOS診治的核心舉措之一。

芍藥甘草湯出自《傷寒雜病論》，歷代醫家對本方的作用趨同于白芍酸斂補益陰血，甘草補益中焦。白芍的關鍵作用在于抑木扶土、疏泄破積。甘草有斂降太陰脾氣的作用，通過降以為補，達到恢復臟腑陰陽之功效[6]。王好古在《湯液本草》中提出了肝苦急，以甘草之甘緩之、白芍之酸瀉之等處方用藥規律。臨床研究表明，芍藥甘草湯可有效作用于HA及PCOS[7-10]。現代藥理學研究顯示，芍藥甘草湯可以降低睪酮值，使其轉變為雌激素[11]，提高了HA患者的生活質量。

中醫藥通過多成分、多靶點、多通路發揮作用。雖然芍藥甘草湯干預多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的作用明確，但關于其發揮作用的主要成分、潛在靶點、生物過程等研究少見。本次通過網絡藥理學方法，分析、預測芍藥甘草湯的成分、靶點及作用于多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的藥物機理。

1 材料與方法

1.1 芍藥甘草湯有效活性成分的檢索與篩選 通過TCMSP數據庫（中藥系統藥理學數據庫與分析平臺）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索白芍、甘草的所有活性成分，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、半衰期（half-life period，HL）、類藥性（drug-like property，DL）是篩選的關鍵參數，以 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h為標準，篩選出符合條件的有效活性成分。

1.2 芍藥甘草湯潛在靶點收集及可視化網絡構建利用TCMSP數據庫搜索白芍、甘草有效活性成分的作用靶點。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫，物種設定為“人”，將所獲得的靶點進行名稱轉換，以解決中藥靶點存在的名稱不標準問題。借助Cytoscape3.7.2軟件構建芍藥甘草湯“中藥-活性成分-靶點”可視化網絡。從而得到芍藥甘草湯治療多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的主要有效活性成分。

1.3 疾病靶點的檢索與預測 以“polycystic ovary syndrome hyperandrogenemia”為關鍵詞，運用Genecards、Drugbank、OMIM數據庫獲取多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的治療靶點。

1.4 藥物與疾病靶點的匹配及蛋白互作網絡（PPI）構建 利用VENNY圖將芍藥甘草湯有效活性成分作用的靶點與疾病的靶點進行匹配，得到芍藥甘草湯與多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的共同靶點。將共同靶點上傳至STRING 11.0數據庫（https：//string-db.org/），將物種設置為“Homo sapiens”，構建 PPI圖。并借用Cytoscape3.7.2軟件中的MCODE插件，篩選出PPI中的關鍵靶點，以獲得芍藥甘草湯治療多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的關鍵靶點。

1.5 基因功能及作用通路分析 運用David數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對關鍵靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，闡明芍藥甘草湯對多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的生物學功能及相關信號通路。

2 結果

2.1 白芍、甘草的有效活性成分及作用靶點 借助TCMSP數據庫，以 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h為標準，共得到83個有效活性成分，其中白芍10個，甘草76個，重合3個。運用TCMSP數據庫，搜索活性成分作用靶點，共得到1 482個，剔除重復后得到244個。將其借助Uniprot數據庫進行名稱轉化，刪除“人”中沒有的，最終得到233個。

2.2 芍藥甘草湯“中藥-活性成分-靶點”可視化網絡構建 將白芍、甘草的有效活性成分及作用靶點上傳至Cytoscape3.7.2軟件，構建芍藥甘草湯“中藥-活性成分-靶點”可視化網絡，見圖1。其中紅色正方形代表2種中藥白芍、甘草；藍色圓形代表中藥所對應的活性成分，其大小與活性成分所對應的靶點數目呈正比；黃色圓形代表2種中藥的共有活性成分。將degree排名前10的活性成分與對應靶點的數目整合至表格中，見表1。由此得出排名最前的活性成分為槲皮素，其次為山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、刺芒柄花素等。

表1 芍藥甘草湯中靶點數目排名前10的活性成分

2.3 多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的相關靶點運用Genecards數據庫，獲得103個基因，刪除重復后得101個；運用Drugbank數據庫，以“Targets”為條件，共得到98個靶點，借助Uniprot數據庫進行基因轉化，刪除重復及“人”中沒有的，得到77個基因；運用OMIM數據庫，以“gene with known sequence”為篩選條件，共得到4 860個基因，刪除1個重復基因后共得到4 859個。將3個數據庫的基因整合，去除重復后共得到4 947個。

2.4 藥物與疾病靶點匹配及PPI網絡構建 利用VENNY圖將芍藥甘草湯與多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的靶點進行匹配，獲得共同靶點125個，見圖2。將共同靶點上傳至STRING數據庫，物種選為“Homo sapiens”，置信度≥0.40，構建 PPI網絡，將所獲得的數據下載為TSV格式，將數據導入Cytoscape3.7.2軟件，以中位數（degree值）>35為標準，篩選出PPI中的關鍵靶點，見圖3。靶點大小與degree值呈正比，靶點越大代表所發揮的作用越強，獲得41個關鍵靶點。根據degree值排序，排名前15的靶點基因見表2。

表2 排名前15的關鍵靶點

2.5 GO基因功能富集分析 將41個關鍵靶點上傳至David數據庫中的基因列表，標識碼為OFFICIAL GENE SYMBOL，清單類型為基因表，選擇物種為“Homo sapiens”，對關鍵靶點進行GO富集及KEGG通路分析，設定閾值P＜0.01。將GO富集結果按P值由小到大排序，P值的大小與富集程度呈負相關，排名靠前的結果見表3，其中12個靶點參與了蛋白質磷酸化的正調控，8個靶點參與了脂多糖介導的信號通路，9個靶點參與了NF-κB轉錄因子活性的正調控，8個靶點參與了細胞對缺氧的反應等。2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析主要涉及107條通路，以P值為排序標準，P值的大小與關聯程度呈負相關，其中與多囊卵巢綜合征高雄激素血癥密切相關前20條通路包括癌癥通路、TNF、HIF-1、FoxO、Toll樣受體、催乳素等信號通路，見表4。

表3 GO功能富集分析

3 討論

HA是PCOS的一個重要病因，可呈現出一系列生殖系統結構及功能異常癥候群，雄激素對婦女健康的最顯著影響是PCOS婦女的HA[12]。“中藥-活性成分-靶點”可視化網絡圖看出，芍藥甘草湯治療的主要活性成分是槲皮素、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、刺芒柄花素等。槲皮素能降低CYP17A1基因的表達，從而抑制磷脂酰肌醇3-激酶以減少雄激素的合成[13]，刺芒柄花素可通過調節NF-κB信號通路的表達，來影響炎癥因子的呈現[14]，進而抑制了雄激素的合成。槲皮素與山奈酚都屬于黃酮類化合物，具有明顯的抗炎作用[15]，炎癥因子水平往往與雄激素水平呈正相關[16]。由此得出，芍藥甘草湯主要通過抗炎特性來發揮治療疾病的作用。

PPI網絡分析發現，MAPK3、TNF、MMP9、IL-6、STAT3、VEGFA等是芍藥甘草湯治療本病的關鍵靶點。MAPK3在卵泡發育及排卵過程中發揮著重要的作用[17]，其可能受雄激素調節，在PCOS中的表達下降[18]。Karimzadeh L 等[19]發現通過抑制 IL-6、COX-2、VEGF、TNF等可降低PCOS患者的雄激素水平。另有發現 PCOS患者的 MMP9、STAT3濃度較高[20-21]，STAT3可以促進IL-6發揮其抗炎特性，MMP9可通過釋放VEGF參與血管生成。由此可知，芍藥甘草湯可以上調MAPK3促進排卵及卵泡黃素化，通過作用于 MMP9、STAT3 來抑制 TNF、IL-6、VEGF 等炎癥和血管生成因子，以達到干預疾病的目的。

GO富集分析顯示，芍藥甘草湯可參與蛋白質磷酸化的正調控、脂多糖介導的信號通路、NF-κB轉錄因子活性的正調控、細胞對缺氧的反應等生物過程。NF-κB通路可以通過介導脂多糖來促進IL-6的表達[22]。氧化應激和缺氧會加速AGE前體的產生，導致轉錄因子NF-κB的激活，進而形成HA[23]。以上研究說明了芍藥甘草湯通過多個生物學過程來治療本病。

KEGG通路分析顯示，芍藥甘草湯可作用于癌癥、TNF、HIF-1、FoxO、Toll樣受體等信號通路。雄激素水平升高可增加子宮內膜增生、癌變的風險[24-25]。Torchen LC等[26]將HA婦女與非HA婦女相比，患轉移性腫瘤和糖代謝障礙的風險增加。TNF-α水平在PCOS患者中顯著升高，大幅度增加了初級卵泡的數目[27]。HIF-1α及其下游蛋白內皮素-2對卵泡的發育及排卵發揮重要的作用[28]，而其在PCOS大鼠卵巢被顯著抑制[29]。FoxO可抑制PCOS巨噬細胞中葡萄糖的攝取[30-31]，并促其產生炎性細胞因子[32]。雄激素會導致脂肪分解，增加游離脂肪酸，而游離脂肪酸的主要配體是Toll樣受體[33]。說明芍藥甘草湯不僅可調節糖脂代謝、保護血管內皮、參與炎癥反應，還可作用于多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的遠期并發癥。

綜上所述，芍藥甘草湯中槲皮素、山奈酚、刺芒柄花 素 等 可 通 過 MAPK3、TNF、MMP9、IL-6、STAT3、VEGFA 等靶點作用于 TNF、HIF-1、FoxO、Toll樣受體等信號通路來調節糖脂代謝、保護血管內皮、參與炎癥反應，以減少雄激素的合成。另外，本研究發現，7-甲氧基-2-甲基異黃酮、β-谷甾醇等也可能是主要活性成分，MYC、PTGS2、EGFR、MAPK1、AKT1、TP53 等可能是其作用靶點，乙型肝炎、催乳素信號通路、胰島素抵抗等可能是其作用通路，為今后深入探討芍藥甘草湯干預多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的作用機制開辟了新思路。