地榆膏對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷的治療作用*

桑龍燕，李 莉，程孝平，谷 梅，李 響，葉伊琳△

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院傷口造口門(mén)診，安徽 合肥 230031）

燒燙傷主要發(fā)生在皮膚或黏膜，嚴(yán)重的燒傷會(huì)導(dǎo)致皮下或黏膜下的組織，如肌肉、骨、關(guān)節(jié)甚至內(nèi)臟等受累，愈合過(guò)程中也易形成感染與瘢痕，給患者造成極大的痛苦和諸多不便。目前治療燒燙傷的化學(xué)藥物較多，主要為抗生素、銀鹽等，作用機(jī)制較為單一，并且近些年抗生素濫用、細(xì)菌耐藥等現(xiàn)象不斷增多[1]，因此研究開(kāi)發(fā)不良反應(yīng)小，多靶點(diǎn)的中藥已成為燒燙傷治療藥物的研究熱點(diǎn)[2-3]。地榆膏為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院特色院內(nèi)制劑，具有清熱解毒、活血生肌、祛瘀通絡(luò)的作用，經(jīng)數(shù)十年的臨床應(yīng)用，顯示出良好的促創(chuàng)面愈合的功效[4]，為進(jìn)一步了解其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用高溫燙傷法建立大鼠深I(lǐng)I度燙傷模型[5]，以美寶濕潤(rùn)燒傷膏和莫匹羅星作為陽(yáng)性對(duì)照組，觀察地榆膏對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面愈合的療效及作用機(jī)制，為地榆膏在臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證SCXK（皖）2017-001。大鼠在室溫（25±5）℃和濕度（50±15）%條件下喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 地榆膏：藥物來(lái)源于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)特色護(hù)理門(mén)診，由地榆、沒(méi)藥、當(dāng)歸、白芷、大黃、紅花等多種中藥粉碎成細(xì)粉，以凡士林等為基質(zhì)混勻加熱制成；美寶濕潤(rùn)燒傷膏（汕頭市美寶制藥有限公司，批號(hào)：1901303B）；莫匹羅星（中美天津史克制藥有限公司，批號(hào)：19070206）；CD31抗體（賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：LS193523）；IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（睿信生物科技有限公司，批號(hào)：07/2019）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 YD-6L生物組織冷凍包埋機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；HM 325石蠟切片機(jī)（Thermo scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Flour Chem M型凝膠成像分析儀（美國(guó) Protein Simple公司）；MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；H3-18KR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為5組，分別為正常組、模型組、美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、莫匹羅星組、地榆膏組，每組18只。各組分籠飼養(yǎng)，保持自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食，定時(shí)清潔消毒。

1.4.2 造模 除正常組外，其余各組大鼠用水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后將大鼠俯臥固定于木板上，用推毛機(jī)推去背毛4 cm×4 cm大小，再用薇婷脫毛膏將該區(qū)域脫凈，消毒。取鐵棒放于沸水中煮30 min后迅速置大鼠脫毛區(qū)15 s，造成面積為10 cm2的深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面[5]，正常組僅麻醉、脫毛。

1.4.3 給藥及取材 造模后立即給藥，各用藥組在每次給藥前，用生理鹽水清洗創(chuàng)面以除去殘留受試物，再將對(duì)應(yīng)藥膏分別涂抹于創(chuàng)面，厚度約1.5 mm，用藥后各組創(chuàng)面保持開(kāi)放。每日給藥2次，間隔12 h，連續(xù)21 d。正常組和模型組僅用生理鹽水外擦脫毛區(qū)，每日2次，正常組定期脫毛，連續(xù)21 d。各組分別在燙傷后7、14、21 d隨機(jī)選取6只大鼠，拍攝創(chuàng)面，并麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心15 min，血清放入-80℃冰箱冷藏備用，用于ELISA檢測(cè)；取創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣正常皮膚間的新生肉芽組織，置4%的多聚甲醛中固定，用石蠟包埋標(biāo)本，切片厚度5 μm，備用。

1.4.4 檢測(cè)指標(biāo) ①創(chuàng)面大體觀察：各組大鼠給藥后每日觀察燙傷部位的腫脹、顏色、創(chuàng)面結(jié)痂以及脫痂等情況。②創(chuàng)面愈合率：將在燙傷后7、14、21 d所拍攝各組大鼠創(chuàng)面照片，結(jié)合Image J軟件計(jì)算創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。③ELISA法檢測(cè)血清中IL-6和TNF-α的含量：取燙傷后第7、14、21 d各組大鼠血清，ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-6和TNF-α的含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。④病理組織學(xué)觀察：取燙傷后7、14、21 d各組大鼠皮膚切片，采用HE染色后，將切片置于顯微鏡×100的視野下觀察。⑤免疫組化法檢測(cè)創(chuàng)面組織CD31的表達(dá)：取燙傷后7、14、21 d各組大鼠皮膚切片，浸入EDTA修復(fù)液中，微波抗原修復(fù)，滴加 CD31（1：600）一抗，4℃冰箱過(guò)夜，按二抗試劑盒說(shuō)明添加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，采用光鏡（×400）觀察細(xì)胞內(nèi)CD31的表達(dá)情況（細(xì)胞內(nèi)含有棕黃色顆粒即為CD31陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞）。每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)視野中CD31陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)比較，采用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；除正常組外的其余4組均數(shù)比較，采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地榆膏對(duì)深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面的整體觀察 各組大鼠燙傷后當(dāng)日皮膚灰白色，皮膚彈性降低；燙傷后1～2 d各組大鼠創(chuàng)面出現(xiàn)不同程度腫脹，后逐漸形成界限清楚的痂皮，其中燙傷后5 d，地榆膏組大鼠最早出現(xiàn)痂皮。燙傷后7 d，地榆膏組大部分大鼠創(chuàng)面無(wú)腫脹，已形成痂皮；美寶濕潤(rùn)燒傷膏組少數(shù)大鼠形成痂皮；莫匹羅星組大鼠創(chuàng)面呈輕度腫脹，未形成痂皮；模型組大鼠創(chuàng)面腫脹明顯、創(chuàng)緣黑紫，均未結(jié)痂。燙傷后14 d，地榆膏組痂皮全部脫落，創(chuàng)面邊緣皮膚愈合顯著；美寶濕潤(rùn)燒傷膏組部分痂皮開(kāi)始脫落；莫匹羅星組和模型組大鼠創(chuàng)面邊緣均見(jiàn)痂皮。燙傷后21 d，地榆膏組大鼠創(chuàng)面明顯愈合，且無(wú)明顯瘢痕形成；美寶濕潤(rùn)燒傷膏組全部脫落，創(chuàng)面面積均明顯縮小；莫匹羅星組和模型組大鼠創(chuàng)面痂皮部分脫落；正常組無(wú)陽(yáng)性癥狀，見(jiàn)圖1。

圖1 傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組創(chuàng)面變化

2.2 地榆膏對(duì)深Ⅱ度燙傷大鼠的創(chuàng)面愈合率影響燙傷后7 d，地榆膏組、美寶濕潤(rùn)燒傷膏組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組（P＜0.05）；燙傷后 14、21 d，3組給藥組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組（P＜0.05），且地榆膏組創(chuàng)面愈合率明顯高于莫匹羅星組（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組創(chuàng)面愈合率（±s，n=6，%）

表1 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組創(chuàng)面愈合率（±s，n=6，%）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與莫匹羅星組比較，△P＜0.05。

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2.3 地榆膏對(duì)深Ⅱ度燙傷大鼠血清中IL-6和TNF-α水平的影響 燙傷后7、14、21 d，模型組血清中炎性因子IL-6和TNF-α水平明顯高于正常組（P＜0.05）；隨時(shí)間進(jìn)程，炎性因子水平逐漸降低；地榆膏組和美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、莫匹羅星組IL-6和TNF-α水平明顯低于模型組（P＜0.05），且變化趨勢(shì)與模型組相同，見(jiàn)表2、表3。

表2 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組IL-6含量（±s，n=6，pg/mL）

表2 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組IL-6含量（±s，n=6，pg/mL）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 7 d 14 d 21 d正常組 127.73±29.13 125.92±17.72 116.41±9.19模型組 335.16.15±31.67#222.48±26.06#174.61±15.24#美寶濕潤(rùn)燒傷膏組 291.05±27.42* 151.85±16.85*130.91±16.68*莫匹羅星組 282.01±26.40* 160.80±21.05*138.56±15.86*地榆膏組 253.24±26.59* 140.13±15.24*128.44±23.56*

表3 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組TNF-α含量（±s，n=6，pg/mL）

表3 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組TNF-α含量（±s，n=6，pg/mL）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 7 d 14 d 21 d正常組 74.32±6.03 67.81±5.08 65.71±6.04模型組 205.71±15.63#141.70±15.55#100.74±9.09#美寶濕潤(rùn)燒傷膏組 168.26±13.64*101.03±12.44*79.07±10.03*莫匹羅星組 145.93±14.19* 92.00±12.03* 85.22±13.86*地榆膏組 156.61±15.43* 85.98±7.18* 70.09±7.80*

2.4 地榆膏對(duì)深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面病理組織學(xué)的影響 正常組各層結(jié)構(gòu)完整，表皮層扁平整齊，毛囊和皮脂腺分布均勻，真皮層組織和附屬結(jié)構(gòu)清晰。燙傷后7 d，地榆膏組、美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、莫匹羅星組和模型組各組大鼠創(chuàng)面組織中可見(jiàn)成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管等增加，且尤以地榆膏組大鼠增加最為明顯。燙傷后14 d，地榆膏組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，表皮增厚，膠原纖維排列趨于整齊，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組次之，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組和模型組較差。燙傷后21 d，地榆膏組大鼠創(chuàng)面組織中的表皮細(xì)胞已基本覆蓋創(chuàng)面，膠原纖維排列整齊；美寶濕潤(rùn)燒傷膏組表皮局灶性上皮島增生；莫匹羅星組和模型組膠原纖維排列仍較紊亂，見(jiàn)圖2。

圖2 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)組織病理學(xué)變化（×100）

2.5 地榆膏對(duì)深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面組織CD31表達(dá)的影響 正常組和各燙傷組大鼠在燙傷后各時(shí)間點(diǎn)CD31均有表達(dá)，且在14 d時(shí)達(dá)到峰值。燙傷后7、14、21 d，模型組創(chuàng)面CD31相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組（P＜0.05）；燙傷后 7 d，地榆膏組、美寶濕潤(rùn)燒傷膏組創(chuàng)面CD31相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組（P＜0.05）；燙傷后 14、21 d，地榆膏組、美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、莫匹羅星組創(chuàng)面CD31相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組（P＜0.05），且地榆膏組創(chuàng)面CD31相對(duì)表達(dá)量明顯高于莫匹羅星組（P＜0.05），見(jiàn)圖 3、圖 4。

圖3 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組CD31蛋白表達(dá)（×400）

圖4 燙傷后不同時(shí)相點(diǎn)各組CD31相對(duì)表達(dá)量

3 討論

地榆膏為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院特色制劑，主要由地榆、沒(méi)藥、當(dāng)歸、白芷、大黃、紅花、冰片等多種中藥制成。具有清熱解毒、活血生肌、祛瘀通絡(luò)之功效，是醫(yī)院長(zhǎng)期用于治療各種燒燙傷等疾病的經(jīng)驗(yàn)方，可縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，臨床療效顯著[4]。本次實(shí)驗(yàn)采用高溫燙傷法制備大鼠深Ⅱ度燙傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地榆膏可明顯減輕創(chuàng)面炎癥、腫脹和壞死等病理改變，促進(jìn)痂殼脫落、成纖維細(xì)胞與毛細(xì)血管生成以及上皮島增生，提高燙傷后不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率，表明地榆膏治療大鼠深Ⅱ度燙傷具有良好療效。

深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)涉及多個(gè)生物學(xué)的比較復(fù)雜的過(guò)程，主要包括炎癥反應(yīng)期、肉芽組織形成期、組織重塑期[6-8]。在中醫(yī)理論體系中，地榆膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合旨在解毒、活血、通絡(luò)、生肌。創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中釋放的炎性因子是影響創(chuàng)面修復(fù)的重要因素之一[9-10]，深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面在愈合過(guò)程中，正氣不足，抗邪無(wú)力，邪毒乘虛而入，易引起感染和炎癥，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，過(guò)度炎癥反應(yīng)則會(huì)延緩創(chuàng)面愈合。炎性因子IL-6和TNF-α是一類(lèi)具有多重免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，是刺激創(chuàng)面愈合過(guò)程所必需的物質(zhì)之一，參與了創(chuàng)面愈合的各個(gè)階段，低水平的IL-6和TNF-α可以直接或間接的刺激巨噬細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、生長(zhǎng)因子以及膠原合成，從而增強(qiáng)創(chuàng)面愈合[11-12]，但濃度過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞凋亡，減少生長(zhǎng)因子和膠原的表達(dá)從而導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合。因此，控制炎性因子的水平對(duì)創(chuàng)面愈合具有重要作用[13-16]。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，地榆膏組可明顯抑制炎性因子IL-6和TNF-α的釋放，與美寶濕潤(rùn)燒傷膏組和莫匹羅星組相比無(wú)明顯差異，也暗示地榆膏解毒之功效可通過(guò)抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)[17-18]來(lái)解釋。

微血管是血液和組織細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所，微血管的結(jié)構(gòu)功能正常與否直接關(guān)系到創(chuàng)面組織的血氧供給、細(xì)胞新生，從而對(duì)促進(jìn)創(chuàng)面愈合起到重要作用[19]。《靈樞·經(jīng)脈》云：“經(jīng)脈十二者，伏行于分肉之間。深而不見(jiàn)……諸脈之浮而常見(jiàn)者，皆絡(luò)脈也。”《臨證指南醫(yī)案》云：“經(jīng)主氣，絡(luò)主血”“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)。”說(shuō)明絡(luò)脈是氣血會(huì)聚之處[20]，在中醫(yī)理論中，微血管相當(dāng)于中醫(yī)的絡(luò)脈，治療上應(yīng)補(bǔ)益氣血，通暢絡(luò)脈。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（PECAM-1）又稱(chēng) CD31，主要存在于血管內(nèi)皮組織，參與維持血管壁屏障的完整性，且是血管內(nèi)皮分化的標(biāo)志，CD31在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中能客觀、直接地反映創(chuàng)面血管生成及愈合程度[21-24]。本實(shí)驗(yàn)中，地榆膏組在燙傷后7、14、21 d創(chuàng)面組織中CD31相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組，顯示其良好的促血管生成作用，與其功效中的“活血、通絡(luò)、生肌”不謀而合。

同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)燙傷后14、21 d，地榆膏組不僅在創(chuàng)面愈合率方面優(yōu)于莫匹羅星組，且在促血管生成方面也優(yōu)于該組，但在抑制炎癥因子方面與該組無(wú)明顯差異，提示了地榆膏多途徑和多靶點(diǎn)的作用帶來(lái)的療效要優(yōu)于作用單一的莫匹羅星，進(jìn)一步顯示了中藥復(fù)方地榆膏治療疾病的優(yōu)勢(shì)。地榆膏方藥組成中地榆、大黃等具有清熱解毒功效，可抑制炎癥反應(yīng)，改善血液循環(huán)[25]；紅花、當(dāng)歸、沒(méi)藥等諸藥共奏活血、通絡(luò)生肌功效，從而使地榆膏在創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮中藥復(fù)方獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)[26-29]。