塔里木馬鹿茸HGF基因部分外顯子克隆及表達特征

王 淼 芮 雪 羅慧麗 韓春梅*

（1塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

鹿茸是迄今為止發現的唯一能夠再生的哺乳動物器官［1］，而器官再生為人類研究提供完美的哺乳動物模型［2］。鹿茸的生長與再生能力是基于干細胞的分裂［3］。在創傷條件下，其微環境變化對鹿茸干細胞的影響可能是促進鹿茸再生及快速生長發育的重要原因。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor,HGF）是最早發現能夠使創傷后肝臟再生的細胞因子［4］，后續研究表明，HGF在細胞、組織修復和再生中起著重要作用。Li等［5-6］對增殖區不同類型組織進行研究，在分子水平揭示了鹿茸快速生長的機制。因此，研究鹿茸組織中的HGF基因及表達特征，為了解HGF基因在鹿茸組織中的調控作用和生長發育機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物與樣品采集

選取2～3歲健康的雄性塔里木馬鹿3頭，使用陸眠寧（1.0 mL/100 kg）麻醉馬鹿采用鋸割法采集新鮮鹿茸頂端組織，用75%的乙醇消毒后，垂直于鹿茸生長軸切取約4～6 cm的鹿茸組織，分離出茸皮、間充質、軟骨、骨組織各100 mg/每塊，放入液氮罐備用。

1.1.2 主要試劑

反轉錄試劑盒、PCR試劑盒、大腸桿菌DH5α、pMD19-T載體、凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa；Trizol、IPTG 均購自 Thermo Fisher；一抗 Anti-HGF（QC45570）購自SIGMA有限公司；二抗（PV-6001）購自中衫金橋；山羊血清封閉液（SL038）、DAB染色劑試劑盒（DA1010）均購自Solarbio；PBS緩沖液購自TBA公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、氨芐青霉素、NaOH、NaCl等試劑產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成

根據GenBank上公布的牛的HGF（AB110822.1）和 GAPDH（NM_001034034.2）基因 mRNA 序列，用Primer5軟件設計塔里木馬鹿HGF5基因和GAPDH基因引物，引物序列分別為F:TACCTAATTATGGGTGCACAATTC，R:TCCATTTTGCATAATATGCCACTC；F:TGTTTGTGATGGGCGTGAACCA，R:ATGGCGTGGACAGTGGTCATAA。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成

液氮罐中取出備用鹿茸組織，放入裝有液氮的研缽中研碎，轉入1.5 ml離心管中，利用Trizol法提取四個組織的總RNA。用RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit進行反轉錄，操作方法按說明書進行。

1.2.3 PCR擴增及克隆

以1.2.2獲得的4個組織的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL：Prime STAR Max Premix（2×）25 μL，cDNA 3 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴增程序：94℃ 3 min預變性；94℃ 30 s變性、55℃ 15 s退火、72℃ 30 s延伸，共35個循環；72℃5 min總延伸。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

對PCR產物進行膠回收后，pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α中［7-10］，涂板于含有Amp+（100 mg/ml）的LB培養基上，37℃過夜。進行菌落PCR，選擇陽性菌落搖菌，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 塔里木馬鹿鹿茸HGF基因序列分析及比對

對獲得的塔里木馬鹿鹿茸HGF部分基因編碼序列進行BLAST分析。

1.2.5 免疫組化

首先將割取鹿茸進行消毒切至0.5～1 cm組織塊，放入倒有Otc的包埋支撐盒中切至6 μL厚度存放-80℃待用。然后將切片放入冷丙酮中固定10 min（溫度4℃），PBS沖洗三次；每張切片加入適量內源性過氧化氫物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，使用PBS緩沖液沖洗3次；每張切片滴加50 μL的10%山羊血清（PBS稀釋）在濕盒中進行密封10分鐘，以防止切片變干；傾去山羊血清，不需要沖洗干凈，滴加一抗后在4℃冰箱里過夜；使用PBS緩沖液沖洗3次（1次/3 min）；滴加酶標山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育20 min；使用PBS緩沖液沖洗3次（1次/3 min）；加入適量新鮮配制的DAB染色劑，室溫孵育5～8 min，自來水沖洗；蘇木素染色液孵育20 s，自來水沖洗；使用倒置顯微鏡進行觀察。

2 結果

2.1 鹿茸RNA提取

塔里木馬鹿鹿茸不同組織的總RNA瓊脂凝膠電泳檢測結果如圖1所示。檢測結果顯示，4個組織均出現3條電泳條帶，分別為RNA的28S、18S和5S。從亮度上可見28S/18S約為2倍，所提取的RNA較完整，符合本實驗要求，可以進行下一步的操作。分別將四種RNA逆轉錄為cDNA，得到的cDNA溶液于-20℃保存。反應產物可以直接作為模板進行PCR擴增反應。

圖1 鹿茸不同組織總RNA檢測結果

2.2 鹿茸HGF基因克隆

取2.1獲得的RNA樣品通過PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到一條約349 bp的目的條帶，與預期片段大小相符，可進行下一步試驗。結果圖2所示：

圖2 塔里木馬鹿鹿茸HGF基因PCR擴增結果

2.3 測序結果與序列分析

HGF基因RNA的測序結果將PCR獲得的HGF部分序列，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得349 bp，以下為測序拼接結果如下：

ACCTAATTATGGGTGCACAATTCCTGAAAAAA CCACTTGCAGTGTTTATGGCTGGGGCTACACTGGAT TGATCAACTCAGACGGTCTACTACGAGTAGCACAT CTCTATATTATGGGGAATGAGAAATGCAGCCAATA CCATCAAGGGAAGGTGACTCTCAATGAGTCTGAAA TATGTGCTGGGGCTGAAAATATTGTATCAGGACCA TGTGAGGGAGATTATGGTGGCCCACTTGTTTGTGA ACAACATAAAATGAGAATGGTTCTTGGTGTCATTG TTCCTGGTCGTGGCTGTGCCATTCCAAACCGTCCTG GCATTTTTGTCCGAGTGGCATATTATGCAAAATGG

本試驗擴增出HGF的RNA序列為349 bp，編碼116個氨基酸。通過比對塔里木馬鹿HGF部分基因與瘤牛（基因序列號XM027539811.1）、普通牛（NM001031751.2）、白尾鹿（XM020876600.1）、山羊（XM013963237.2）、綿羊（XM027968556.1）、野 豬（XM021063486.1）、野駱 駝（XM006194336.2）、馬（XM023639072.1）、野驢（XM014855377.1）、野 馬（XM008538444.1）相應的同源性分別為98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%、96.56%、95.70%、95.42%、95.42%、95.42%。HGF基因在物種間的高同源性表明它們在進化過程中非常保守，即在不同物種中的功能具有相似性。

2.4 HGF基因在塔里木馬鹿鹿茸不同組織中的表達

經過免疫組化檢測，HGF基因在鹿茸茸皮、間充質、軟骨和骨組織中均有陽性反應，且茸皮組織和軟骨組織中陽性反應表達明顯，間充質組織和骨組織中陽性反應表達微弱。

HGF在塔里木馬鹿鹿茸皮層的表達免疫組化結果見圖3。

圖3 鹿茸茸皮組織免疫組化結果

在倒置顯微鏡下可以看到，茸皮是由表皮、真皮和皮下結締組織組成，真皮由網狀結構構成，并且存在大量毛囊和皮脂腺，皮下結締組織中由許多血管和纖維的分布（見圖3中A、B、C和D）。從圖片中觀察到鹿茸茸皮組織免疫組化實驗組有黃褐色陽性反應出現，主要分布在鹿茸茸皮組織真皮表皮中間基底層和毛囊周圍的皮脂腺上（見圖3中B、C和D），對照組為陰性反應（見圖3中A），說明鹿茸茸皮組織中存在肝細胞生長因子的表達，且表達明顯。

塔里木馬鹿鹿茸HGF基因在間充質組織中也有表達，但表達微弱如圖4。

通過倒置顯微鏡下觀察，可以明顯看到鹿茸間充質層組織中細胞排列緊密，大部分細胞核細長呈梭形，排列方向與生長軸垂直，少數與生長軸平行，存在血管結構（見圖4中E、F、G和H）。從圖片中觀察到鹿茸間充質組織免疫組化實驗組中間充質細胞和基質中有少量的黃褐色弱陽性反應出現（見圖4中F、G和H），對照組為陰性反應（見圖4中E），說明鹿茸間充質組織中存在肝細胞生長因子的表達，但表達微弱。

圖4 鹿茸間充質組織免疫組化結果

塔里木馬鹿鹿茸HGF基因在軟骨層中也有表達，陽性信號特征鮮明，如圖5。

圖5 鹿茸軟骨組織免疫組化結果

通過倒置顯微鏡下觀察，可以明顯看到鹿茸軟骨組織是由軟骨細胞、軟骨基質和膠原纖維組成，軟骨細胞形態極不規則，細胞核仁不明顯，圍繞著管道呈螺旋狀排列，有一定的規律，基質內具有明顯的隱窩可以將基質和軟骨細胞隔開，軟骨組織中存在大量血管（見圖5中I、J、K和L）。從圖片中觀察到鹿茸軟骨組織免疫組化實驗組中軟骨細胞和基質有陽性反應出現（見圖5中J、K和L），對照組為陰性反應（見圖5中I），說明鹿茸軟骨組織中存在肝細胞生長因子的表達，且非常明顯。

塔里木馬鹿鹿茸HGF基因在骨組織中表達微弱，如圖6。試驗組骨細胞及其周圍有黃褐色陽性反應出現（N、O和P）對照組M陰性反應。

圖6 鹿茸骨組織免疫組化結果

在倒置顯微鏡下可以看到，骨組織是由細胞、纖維和基質組成，分布大量排列不規則的骨小梁，骨小梁附近分布著大量血管（見圖6中M、N、O和P）。從圖片觀察到鹿茸骨組織免疫組化200X實驗組骨細胞及其周圍有黃褐色陽性反應出現（見圖6中P），對照組為陰性反應（見圖6中M），說明鹿茸骨組織中存在肝細胞生長因子的表達，但是表達微弱。

3 討論

肝細胞生長因子（HGF）發現于上個世紀，從肝細胞中鑒定并克隆得到。隨著后期研究發現HGF系統廣泛表達于多種組織并參與復雜的生物學過程，調節細胞生長、運動以及組織形態發生，對多種組織器官的發生發育、修復再生有著至關重要的作用［11］。Liu等［12］發現HGF上調MSCs的c-Met和磷酸化Met的表達，增強其肝保護作用。Transwell檢測顯示HGF能夠促進MSCs遷移，而且介導了BMSCs誘導的肝修復。Bai L［13］發現該信號促進少突膠質細胞增殖并和神經元的發育密切相關。Wen Q等［14］發現HGF濃度的連續變化對體內MSCs的增殖和成骨分化有明顯的作用。

現階段研究中，大多學者把鹿茸再生作為再生醫學熱點研究模型［15-16］。因此，本研究以塔里木馬鹿鹿茸HGF基因為候選基因。將塔里木馬鹿鹿茸HGF與其他物種進行比對分析，發現與瘤牛、普通牛、白尾鹿、藏羚羊和綿羊的HGF核苷酸序列同源性較高，分別為 98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%。本研究利用免疫組化試驗檢測塔里木馬鹿鹿茸頂端茸皮組織、間充質組織、軟骨組織和骨組織HGF基因的表達，結果顯示，HGF在茸皮組織和軟骨組織中表達明顯，在骨組織和間充質組織中微弱。說明HGF基因對鹿茸頂端生長發育有調節作用，為進一步研究HGF的功能和鹿茸快速生長的調節機制奠定基礎。目前，關于塔里木馬鹿HGF基因在分子水平上研究的報道較少，其具體生長調節機制還需進一步研究。

4 結論

本試驗通過PCR方法擴增、克隆塔里木馬鹿鹿茸中HGF部分外顯子序列349 bp，與其他物種序列比對結果表明，塔里木馬鹿鹿茸中HGF基因序列與瘤牛、普通牛、白尾鹿、藏羚羊和綿羊等同源性較高，分別為 98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%。免疫組化檢測結果顯示，HGF在茸皮組織和軟骨組織中表達明顯，在骨組織和間充質組織中微弱。